Když parazit napadá organismus, pronikají do buňky jeho nukleové kyseliny, bílkoviny a polysacharidy. Dříve, než buňka zahájí obranu, musí rozpoznat vlastní makromolekuly od cizorodých. Jinak by totiž obranné mechanismy buňky mohly napadnout vlastní makromolekuly. Ukazuje se, že problém rozpoznání vlastních makromolekul od cizích je z biochemického hlediska mnohem náročnější, než vlastní obrana. Jednotlivosti rozpoznávacích mechanismů patří zatím k nevyřešeným problémům molekulární biologie. Jakmile jsou makromolekuly rozpoznány jako cizí, stanou se nakonec obětí různých enzymů, které je rozloží na nízkomolekulární části a agresor je tím zničen.

Na nejnižších stupních říše organismů, u baktérií, existuje rozpoznávací obranný mechanismus vůči cizí dědičné látce DNA. Účinkuje také vůči DNA bakteriofágů a díky tomu byl tento mechanismus asi v 60.letech 20.století objeven. Jako příklad vezmeme lytickou infekci (tedy nikoliv lysogenii) u různých kmenů E.coli fágem lambda. V tekutém kultivačním médiu necháme namnožit fágy lambda na kmeni K baktérie E.coli. Toto fágové potomstvo vyvolá na vrstvě téhož kmene E.coli tolik plaků, kolik obsahuje virových částic. Pravděpodobnost, s jakou fágová částice zahajuje nový pomnožovací cyklus, je tedy rovna téměř 100%. Když však tytéž fágy lambda, které se namnožily na kmeni K E.coli naočkujeme na kmen B E.coli, tak pravděpodobnost tvorby plaků klesla na 0,01%. Když však vezmeme potomstvo této zřídkakdy úspěšné infekční události a naočkujeme je na oba kmeny E.coli, zjistíme, že jsou schopny úspěšně infikovat kmen B, ale kmen K pouze s hodnotou 0,05%. Nejde však o mutaci fágů, protože jediný pomnožovací cyklus na původním hostiteli, tj. kmenu K, obnoví původní poměry: fág dobře infikuje kmen K E.coli a špatně infikuje kmen B.

Ryze formálně lze uvedené schéma infekce vysvětlit dvěma vlivy hostitelských buněk na fágy. Zdá se, že dochází k modifikaci fágů těmi hostitelskými buňkami, ve kterých se fágy tvoří. Tato modifikace by vysvětlila, proč fágy vyrostlé na různých kmenech E.coli se chovají různě.

V určitých případech může docházet k odmítnutí neboli "restrikci" fágů těmi buňkami, které chceme naočkovat. Když fágy vznikly na jiném kmeni, je jejich modifikace příslušnému kmenu cizí a úspěch infekce může být v důsledku restrikce nepatrný.

Uvedené principy jsou však myšlenkovou abstrakcí. Nejdříve se podařilo alespoň částečně osvětlit proces restrikce. Byly nalezeny mutanty E.coli, které ztratily schopnost k restrikci. Na nich se mohly fágy množit nezávisle na svém původu. Restrikce je tedy pozitivním výkonem divokého typu E.coli.

V dalších pokusech byly molekuly DNA fágů radioaktivně označeny během tvorby v určitém kmenu E.coli, aby se zjistilo, co se děje s fágy, když napadnou buňky jiného kmene E.coli. Zjistilo se, že se fágy zcela normálně připojí na buněčnou stěnu a rovněž mohou vpravit do buňky svoji DNA. Avšak místo toho, aby tato DNA zahájila rozmnožovací cyklus, je napadena enzymy buňky E.coli a je rozložena. Abstraktní pojem restrikce tak dostal konkrétní biochemický význam.

Tyto nálezy získaly všeobecný význam, když se ukázalo, že restrikce a modifikace nepůsobí jen na bakteriofágy, ale také na DNA E.coli. Když se přenáší DNA při párování dvou buněk E.coli, může dojít ke genetické rekombinaci jen tehdy, když obě buňky patří ke stejnému kmeni. Pokud párujeme samčí buňku kmene K se samičí buňkou kmene B, je DNA vpravená buňkou kmene K rozložena enzymy a pravděpodobnost rekombinace je malá. Obecně se obranný mechanismus buněk E.coli obrací proti každé DNA, která není označena jako příslušející danému kmeni.

K odbourání DNA potřebuje buňka enzym desoxyribonukleasu (zkratkou DNAasu). Záhadou je, jak tato DNAasa rozpozná vlastní DNA od cizí DNA. Nemá snad DNA v celé říši organismů univerzální molekulární strukturu? Čím se kromě sledu bází ještě odlišují DNA různých organismů? Jak může molekula enzymu "přečíst" tisíce bází DNA, aby rozpoznala, zda jde o vlastní nebo o cizí DNA? Ukázalo se, že mechanismus rozpoznávání nesouvisí s obsahem dědičné informace v molekule DNA.

Bylo zjištěno, že baktérie mohou určit DNA jako cizí podle určitého chemického značkování molekuly. K tomuto značkování používá bakteriální buňka methylové skupiny, které jsou dodatečně napojeny na určité báze DNA. Methylové skupiny neovlivňují Watson-Crickovo párování bází a proto nemají žádný význam pro genetickou informaci. Enzym, který přenáší methylové skupiny, je vysoce specifický. Methylové skupiny přidává pouze na určité báze, které se nacházejí v určitém úseku sledu bází, délky asi 10 členů řetězce. Tento sled bází se vyskytuje jen relativně zřídka, takže DNA fágu může být úplně označena napojením jen několika methylových skupin.

Restrikci, to znamená odbourání neoznačené DNA, provádějí DNAasy, které neustále zkoumají DNA podle úseků a pokud zjistí, že chybí methylová skupina, provedou odbourání. Vznikající DNA fágu, která není modifikována podle vlastního kmene, se stane v 99,99% případech obětí tohoto enzymu. Ve výjimečných případech kdy není cizí DNA fágu napadena, je označena methylovými skupinami za vlastní a dojde k reprodukci fágů. Neúspěch takto vzniklých fágů při infekci původního hostitele lze vysvětlit tím, že každý kmen značkuje své charakteristické úseky bází. DNAasám kmene K je jedno, zda DNA není označena nebo je označena methylovými skupinami v úsecích charakteristických pro kmen B. Vždy dojde k jejímu odbourání.

Zcela jedinečný obraz molekulárního existenčního boje mezi fágy a baktériemi poskytují fágy T4. Tyto fágy zničí DNA svého hostitele E.coli a uvedou do chodu vlastní množení. To předpokládá rozdílnost obou typů DNA. Proto fágy T4 obsahují hydroxymethylové skupiny na bázích cytosinu. Tuto modifikaci provádí enzym, který je kódován genem na fágové DNA. Baktérie vyvinuly obranou DNAasu, která štěpí pouze takto pozměněnou DNA. Tento enzym však můžeme prokázat pouze za určitých okolností, protože fágy vytvářejí naopak enzym, který připojuje aktivovanou molekulu glukosy na pozměněnou bázi hydroxymethyl-cytosinu. Místo jednoduchého cytosinu má tedy fág T4 zastoupen v určitém množství bizarní glukosyl-hydroxymethyl-cytosin. Zatím se neprokázalo, že by E.coli vyvinuly nějakou novou DNA-asu, která by rozpoznala i takto pozměněnou molekulu DNA.

Také u vyšších organismů, a to u teplokrevných, existuje obranný mechanismus proti cizím nukleovým kyselinám. Úlohu tu hraje bílkovina vyráběná hostitelskými buňkami zvaná interferon (interferovat = zamezovat). Jeho tvorba je například vyvolána různými živočišnými viry, a to i tehdy, když se po UV ozáření stanou virové částice biologicky neškodnými. Interferon inhibuje zatím neznámým způsobem zmnožení různých virů, přičemž nezáleží na tom, jaký virus vyvolal jeho tvorbu. Vyčištěnými preparáty interferonu lze ochránit i buňky, které nikdy nepřišly do styku s viry nebo cizími nukleovými kyselinami. Tyto buňky však musí být stejného živočišného druhu, z jakého byl získán interferon. Bílkovina interferon je tedy specifická pro hostitelské buňky, nikoliv virově specifická. Působíme-li na myší buňky v tkáňových kulturách ribonukleovou kyselinou ze slepičích buněk, stanou se rezistentními vůči následné virové infekci. Tento jev nezjistíme, použijeme-li myší RNA. A opačně, slepičí buňky se stanou rezistentními působením myší RNA, nikoliv působením slepičí RNA. Rezistence spočívá na tvorbě interferonu. Na základě těchto nálezů bude možné i v klinické praxi použít uměle syntetizované preparáty RNA, neboť některé z nich stimulují obzvláště výraznou tvorbu interferonu. Nukleová kyselina vyvolává tvorbu interferonu tehdy, je-li rozpoznána jako cizí.

Nejdéle známými biologickými obrannými látkami u savců jsou protilátky. Protilátky jsou bílkoviny v krevní plasmě, které cizí látku zneškodňují tím, že se na ni vážou a tyto komplexy pak jsou odchytány speciálními fagocytujícími buňkami. Z medicinského hlediska jsou důležité pojmy "pasivní" a "aktivní" imunizace. Pasívní imunizací je obrana poskytnutá injekcí specifických látek, které byly získány z jiného organismu. Aktivní imunizace je podnět k tvorbě vlastních protilátek vůči určitému původci choroby, vyvolaný injekcí usmrcených nebo nepatogenních zárodků tohoto druhu. Protilátkový systém je založen na jiném principu než obrana interferonem. Účinek protilátek není omezen na určitý hostitelský organismus, ale je specifický pro určité původce choroby.

Většina makromolekul, které jsou cizí, při průniku do krevního oběhu vyvolá tvorbu protilátek. Makromolekuly působí jako antigeny (látka vyvolávající tvorbu protilátek). O tom, co je organismu "cizí" nebo "vlastní" se rozhoduje zatím neznámým způsobem zřejmě v době narození. Tímto způsobem je narušena možnost imunitní obrany proti cizím látkám, které vniknou do krevního oběhu organismu ještě před narozením nebo těsně po něm. Tento stav se označuje jako "imunní tolerance". Může také dojít k tomu, že některé části orgánů, které jsou normálně mimo krevní oběh, se do něj poraněním nebo degenerací uvolní. Tyto části jsou pak v krevním oběhu "cizí" a mohou vyvolat nebezpečnou reakci imunitního systému. Tento stav se označuje jako "autoimunita".

Jako přirozené antigeny působí především polysacharidy a bílkoviny. Pouze makromolekuly nebo jejich komplexy vyvolávají tvorby protilátek. Protilátky jsou namířeny proti poměrně malým úsekům makromolekuly. Proto určitý druh makromolekul vyvolává různé typy protilátek. Konkrétním příkladem jsou látky krevních skupin na membráně červených krvinek.

Pokud křížově smísíme krev různých osob, uvidíme, že pouze v určitých kombinacích dojde ke shlukování červených krvinek. Toto pozorování vedlo Landsteinera asi počátkem 20.století k objevu AB0-systému krevních skupin. Shlukování krvinek v laboratorním pokuse ukázalo, že v takovém případě může být krevní transfúze nebezpečná, protože se vyskytuje "nesnášenlivost" antigenů červených krvinek. Určení krevní skupiny je proto důležité v praktické medicíně. V praktické medicíně se dává přednost přenosu krve v rámci jedné krevní skupiny. Zejména trasfúze krevní skupiny O na jiné skupiny se provádí jen v krajním případě.

Shlukování červených krvinek člověka s krevní skupinou A krví člověka se skupinou B je vyvoláno protilátkami v krevním séru B. Tyto protilátky jsou namířeny proti antigenu A an povrchu membrány krvinek. Schopnost tvořit látku A nebo B nebo žádnou z těchto látek podléhá při předávání dědičných faktorů Mendelovým zákonům, pokud uvážíme tři různé alely příslušného genu I.

Schopnost tvořit A nebo B (alely IA, IB) jsou dominantní nad neschopností syntetizovat některou z těchto látek (alela I0). Příslušníci ke krevní skupině 0 netvoří ani látku A, ani látku B a jejich krev obsahuje protilátky proti oběma. Tyto protilátky jsou sice při transfúzi zředěny, ale přesto mohou být pro příjemce s krevní skupinou A, B nebo AB škodlivé.

Látky krevních skupin A a B byly chemicky identifikovány jako postranní řetězce membránového polysacharidu. U látky A je určující skupinou N-acetyl-galaktosamin-galaktosa, u látky B je určující skupinou D-galaktosa (viz příloha 3).

Taková seskupení sacharidů se vyskytují náhodně na buněčné stěně střevních baktérií. Tyto součásti buněčné stěny se mohou dostat střevní sliznicí do krevního oběhu a vyvolat tvorbu protilátek. Protože je vůči vlastní krevní skupině tolerance, vytváří se protilátky pouze proti těm postranních řetězců, které se nevyskytují na membránách vlastních červených krvinek. Tento nález vysvětluje, proč se v krevním séru vyskytují protilátky proti cizím červeným krvinkám, se kterými se organismus nikdy nedostal do styku. Tyto protilátky jsou namířeny proti střevním baktériím. Důsledkem přírodou "neplánované" krevní transfúze jsou pak lékařsky nežádoucí vedlejší účinky této obrany.

Molekuly protilátek jsou vytvářeny lymfoidními buňkami a jsou uvolňovány do krve. Speciální lymfoidní buňkou je plasmatická buňka. Účinkem antigenu vznikají tyto buňky v lymfatických uzlinách a slezině intenzivním dělením a diferenciací prekursorových buněk, malých lymfocitů.

Z toho, že dva tak odlišné útvary jako bakteriální buňky a červené krvinky vyvolávají identické sérologické reakce, by se mohlo soudit, že rozpoznávací schopnost protilátkového systému není příliš velká. Tento dojem je mylný. Polysacharidy mají jen omezenou schopnost antigenních variací a proto se může vyskytnout křížová reakce. Vysoká rozlišovací schopnost imunitního systému se jasně projeví, pokud nabídneme jako antigeny bílkovinné molekuly. Lze vyvolat protilátky vůči tisícům různých bílkovin aniž se setkáme s křížovou reakci. Imunitní systém může dokonce vytvořit protilátky proti synteticky připraveným molekulám, které se vůbec nevyskytují v přírodě. Syntetické malé molekuly je však třeba vázat na makromolekuly, aby účinkovaly jako antigeny. Imunitní systém je schopen vytvořit více než milión různých protilátek.

Protilátky jsou z biochemického hlediska gama globuliny (na rozdíl od sérového albuminu a jiných bílkovin séra). Existují různé třídy gama globulinů, označované jako imunoglobuliny: IgM, IgG, IgA atd. Pojednáme zde pouze o gama globulinech igG, které se vyskytují nejčastěji. Metodou negativního barvení byly nedávno pořízeny v elektronovém mikroskopu s vysokou rozlišovací schopností snímky těchto protilátek a také jejich komplexů s antigeny. Molekula imunoglobulinu připomíná písmeno Y a vazebná místa, kde se napojuje antigen jsou na koncích obou ramen Y. Molekula je vybudována symetricky a obě vazebná místa mají tutéž specifitu, tj. vážou se se stejnou povrchovou strukturou antigenu. Představme si jako antigeny virové částice nebo buňky baktérií. Jejich povrch je složen z opakujícího se molekulárního vzoru a proto se stejné antigenní struktury vícekrát opakují. Na jednu antigenní částici se tak může navázat více molekul protilátek. Protože každá molekula imunoglobulinu IgG má dvě ramena, mohou se na tato ramena opět umístit nové antigenní částice. Tím vzniká rozsáhlá nepravidelná síťovitá struktura, která se z roztoku vysráží jako vločka. Tyto vločky vidíme, pokus smísíme ve zkumavce antigen a sérum obsahující protilátky proti použitému antigenu. V krevním oběhu organismu je toto shlukování prvním krokem k zneškodnění antigenů, protože tyto shluky lze snadněji pohltit fagocytujícími buňkami.

Klíč k pochopení imunitní reakce leží v molekulární stavbě protilátkové molekuly. Lze si představit, že na obou ramenech je určitý reliéf, do kterého předně zapadá povrchová struktura antigenu, proti kterému je namířena protilátka. Jak však dojde k tomu, že určitý antigen vyvolá tvorbu odpovídajících protilátek? Americký biochemik Linus Pauling byl první, kdo se pokusil tuto otázku zodpovědět. Pauling si představoval, že antigen vnikne do buňky tvořící protilátky a tam vtiskne vznikajícím molekulám protilátek správnou povrchovou strukturu. Podle této úvahy by bylo možné, že protilátky jsou složeny ze stejných polypeptidů, které se jenom různě prostorově stáčí.

Tato hypotéza byla jednoduchým pokusem vyloučena. Byly vyčištěny protilátky namířené proti určitému antigenu. V nepřítomnosti antigenu byly tyto protilátky rozpouštědlem denaturovány a tím bylo rozrušeno jejich prostorové stočení. Poté se rozpouštědlo odstranilo, aby se molekuly protilátek mohly v nepřítomnosti antigenu renaturovat. Ukázalo se, že protilátky svoji schopnost vázat antigeny neztratily. Informace ke správnému prostorovému stočení polypeptidického řetězce tedy leží již ve sledu aminokyselin, z nichž je řetězec sestaven, stejně jako tomu bylo u enzymů a strukturálních bílkovin. Pokud tento výsledek obrátíme, pak statisíce různých protilátek lze vysvětlit pouze statisíci různými sledy aminokyselin. To by ovšem znamenalo statisíce dědičných faktorů pro imunitní ochranu organismu.

V posledních letech byla detailní stavba protilátek blíže osvětlena. Molekuly protilátek třídy IgG tvaru Y jsou sestaveny ze dvou delších (těžších, H) a ze dvou kratších řetězců (lehčích, L), které jsou vzájemně spojeny disulfidickými můstky. Vždy jeden lehký L a část těžkého H řetězce tvoří jedno rameno Y, prostřední rameno Y je tvořeno zbývajícími částmi řetězců H. Vazební místa pro antigen jsou na koncích ramen. Proto výstavby vazebního místa se účastní jen určité části obou typů řetězců. To je z hlediska molekulární genetiky uspokojující, protože to umožní vznik miliónů různých protilátek pomocí asi dvou tisíc genů.

Připravit dva tisíce různých sledů aminokyselin, z nichž ten správný sled se v případě potřeby začne vytvářet hromadně, je stále ještě mimořádný výkon organismu. Muselo se proto nejdříve biochemickými metodami ověřit, zda skutečně existuje tato předpokládaná rozmanitost sledů aminokyselin.

Pro biochemika není problém vyčistit z krevního séra určitou třídu protilátek. Takový preparát však stále obsahuje směs protilátek různých specifit, tj. protilátek namířených proti různým antigenům. Sled aminokyselin však lze zkoumat teprve tehdy, když jsou molekuly vzorku identické. V této situaci pomohla molekulárním biologům určitá choroba. Tak jako všechny buněčné typy, mohou se i buňky tvořící protilátky začít neřízeně množit a tvořit nádory. Byly zjištěny nádory jak u lidí tak u laboratorních myší, jejichž buňky produkovaly ve velkém molekuly protilátky. Z některých nádorů tohoto typu byly založeny tkáňové kultury, ve kterých lze pěstovat buňky za laboratorních podmínek. Nejdůležitějším nálezem bylo, že tyto nádory syntetizují pouze jeden typ molekul protilátek. Tím bylo získáno dostatečné množství vzorku pro biochemickou analýzu.

Podstatné výsledky se začaly objevovat až po prozkoumání protilátek z nádorů různého původu. Bylo zjištěno, že části lehkých a těžkých řetězců, které nesou karboxylový zbytek, mají konstantní sled aminokyselin. Naproti tomu části na aminových koncích (ramenech Y) mají u obou řetězců variabilní sled aminokyselin podle původu protilátek. Specifita protilátek je tedy určena sledem aminokyselin.

Jak však lze vysvětlit specifickou imunitní odpověď organismu na genetické a na buněčné úrovni? Pokud se týče genetické úrovně, dosud nebylo experimentálně rozhodnuto mezi hypotézami:

1. Pro speciální účel imunitní reakce se z generace na generaci dědí tisíce genů. Buňky vyšších organismů mají tak velké množství DNA, že umístění těchto genů není problémem.

2. Mnohost protilátkových genů vzniká v embryonálním vývoji, a to: a) nebyčejnou zvýšenou četností mutací protilátkového prekursorového genu b) neobvykle častou rekombinací mezi poměrně malým množstvím různých protilátkových genů

Jak známo, určitá buňka tvoří většinou protilátky jediné specifity. Podle hypotézy 1 by to znamenalo, že v určitém časovém okamžiku, např. při styku s antigenem, se aktivuje jediný protilátkový dědičný faktor, kdežto ostatní jsou blokovány.

Atraktivní je klonální selekční teorie, kterou navrhl australský virolog a imunolog Burnet. Podle této teorie existuje již připravený velký počet mateřských lymfoidních buněk, zejména v lymfatických uzlinách a slezině, které se ještě před prvním stykem s antigenem "rozhodly" pro tvorbu látek určité specifity. Několik vzorových exemplářů jejich imunoglobulinu se nachází na jejich buněčném povrchu. Jestliže určitý antigen vnikne do krevního oběhu, dostane se do styku s velkým počtem čekajících předurčených buněk. Vazba antigenu s povrchovým imunoglobulinem vyvolá biochemický signál, který navodí dělení prekursorové buňky. Vznikne tak mnoho buněk stejného typu a protože pocházejí z jediné mateřské buňky, tvoří klon. U buněk indukovaných k tvorbě protilátek se zvětšuje cytoplasma a na ribosomech se provádí syntéza specifické protilátky, která prochází buněčnou stěnou a uvolňuje se do krevního oběhu. Burnetova teorie, na rozdíl od Paulingovy teorie, nevyžaduje, aby antigen vnikl do buňky, která vytváří protilátky. Klonální selekční teorie může vysvětlit časové zpoždění imunitní reakce při prvním vpravení antigenu do organismu tím, že musí dojít k dělení buněk. Dobře se tato teorie shoduje s pozorováním, že nádory imunitního systému tvoří protilátky jediné specifity. Podle Burneta totiž mají i v normálním případě všechny buňky, které tvoří určitou protilátku, pocházet z jediné mateřské buňky. Burnetova teorie však nic neříká o tom, jakým genetickým mechanismem vznikla původní mnohost mateřských buněk.

"To co platí pro baktérie E.coli, platí také pro slony". Podle této zásady francouzského biochemika Monoda postupují dnes při zkoumání vyšších organismů mnozí molekulární biologové. Některé imunitní reakce, například tvorba protilátek, je zatím jasně prokázána až u obratlovců, především u savců. Abychom však těmto reakcím porozuměli, uchylujeme se často k principům, které byly rozvinuty v molekulární biologii při zkoumání baktérií a virů.

V této kapitole shrneme některé nálezy, které molekulární biologie dosud získala u vyšších organismů. Pod pojmem "vyšší organismy" obvykle rozumíme organismy, jejichž buňky mají jádro ohraničené membránou. Náleží k nim nejen mnohobuněčné organismy, jako jsou rostliny a živočichové, ale také jednobuněčné živé organismy, jako jsou prvoci, trepky nebo kvasinky. Tyto organismy s ohraničeným buněčným jádrem nazýváme eukaryonty, na rozdíl od organismů, které mají předstupně buněčného jádra a které nazýváme prokaryonty. K prokaryontům patří vedle baktérií také modré řasy.

Buňky vyšších organismů mají obvykle několikatisícinásobný objem než bakteriální buňky. Zatímco buněčný prostor buněk bakterií není rozdělen nebo je rozdělen pouze jednoduchým způsobem, představuje buňka vyšších organismů složitý systém otevřených a uzavřených dílčích prostorů oddělených buněčnými membránami.

Největší část DNA vyšší buňky je umístěna v buněčném jádru v chromosomech. DNA je u vyšších organismů, stejně jako u baktérií a virů, nositelkou dědičné informace. Jednoduchá sada chromosomů člověka z jedné pohlavní buňky obsahuje tolik DNA, že za sebou seřazená natažená vlákna DNA by dosáhla délku asi jednoho metru. DNA bakteriálního chromosomu tvoří kruh s délkou obvodu asi jednoho milimetru (přitom bakteriální buňka je dlouhá asi dvě tisíciny milimetru). Znamená to, že DNA člověka obsahuje tisíckrát více dědičných faktorů než E.coli? Nebo existují u DNA vyšších organismů úseky, které neodpovídají genům u baktérií a mají jinou funkci? Nebo se snad určité dědičné faktory násobně opakují?

Zdálo by se, že první možnost je přijatelná. Bylo však pozorováno, že obsah DNA v zárodečných buňkách blízce příbuzných rostlin nebo obojživelníků se někdy liší o deset i více řádů. Někteří obojživelníci dokonce mají v jedné chromosomální řadě asi dvacetkrát více DNA než člověk. Je tedy nepravděpodobné, že by větší množství DNA odpovídalo větší genetické rozmanitosti. K rozdílům v obsahu DNA pohlavních buněk se přiřazují určité specializace tkáňových vyšších organismů spojené s replikací DNA. U některých much a komárů existují obří chromosomy, v nichž jsou tisícinásobně se opakující řetězce DNA. Tento stav se však nedědí jako takový, ale nově se utváří při vývoji každého jedince.

Co říká klasická genetika vyšších organismů možnosti, že určité dědičné faktory se vyskytují v mnohonásobném provedení? S výjimkou určitých hub, řas a mechů mají vyšší organismy diploidní nebo multiploidní tělní buňky. Musíme tedy počítat s nejméně dvojnásobnou přítomností dědičných faktorů. Vzhledem k tomu je sice genetické zkoumání vyšších organismů poněkud zdlouhavé, avšak jak ukázal Mendel, dostaneme se vhodnými pokusy křížení k cíli. Předáváním dědičných faktorů lze identifikovat jednotlivé faktory i tehdy, jestliže se znak projevuje recesivně. Srpkovitá anémie je příkladem dědičné odchylky, která se podle Mendelových pravidel projeví v určitém poměru u potomků a u které známe bílkovinu příslušející defektnímu genu. Kdyby však byl dědičný faktor pro určitou bílkovinu přítomen v desetinásobném provedení, byla by mutace jednoho z těchto faktorů prakticky bez biologických následků a defektní bílkovinu bychom neobjevili obvyklými prostředky. Pokud sestavíme katalogy dědičných faktorů u vyšších organismů na základě pozorovaných mutací, musíme počítat s možností, že náš výběr rozhodně nebude reprezentativní. Metodami klasické genetiky lze stěží zjistit, zda se dědičné faktory vyskytují mnohonásobně.

Proto byla vyvinuta biochemická metoda umožňující zjistit, zda se v DNA vyšších organismů určité sledy násobně opakují. Využívá se párování bází mezi jednopramennými molekulami nukleových kyselin, které mají komplementární sled bází. Zkoumaná DNA se nejdříve rozruší ultrazvukem na přibližně stejně dlouhé úseky. Tyto dvojpramenné úseky DNA jsou zahřátím na 90 až 100 stupňů Celsia denaturovány a tím se prameny od sebe oddělí. Pokud tuto směs ponecháme při nízké teplotě, lze sledovat, jak se rychle opět tvoří dvoupramenná DNA. Předpokladem této renaturace je, aby se setkaly prameny s plně nebo alespoň částečně komplementárním sledem bází. Dojde k tomu o to častěji a renaturace proběhne o to rychleji, čím častěji se vyskytuje v roztoku určitý sled bází a jemu odpovídající úsek. Pokud srovnáme průběh reakce DNA viru a baktérie, zjistíme, že při stejných koncentracích bude DNA viru renaturovat rychleji. Velikost celkového genomu je u viru menší a úseky DNA najdou své partnery rychleji než u DNA baktérií, která obsahuje větší rozmanitost sledů bází. Dalo by se tedy očekávat, že DNA vyššího organismu bude renaturovat ještě pomaleji než je tomu u baktérie, protože genom má velikost o několik řádů vyšší. U části DNA myši, hovězího dobytka nebo člověka skutečně dochází k očekávané pomalé renaturaci. Značná část DNA však renaturuje dokonce rychleji než virová DNA. Tato DNA musí obsahovat stejný nebo podobný sled bází, který se mnohonásobně opakuje. Jde tedy o redundantní DNA, což znamená, že obsahuje stejný obsah informace vícekrát. U virů a baktérií nenajdeme téměř žádnou redundanci.

Proč však existuje redundance genetické informace? Jedna z hypotéz předpokládá, že jde o násobně se opakující "programy" pro čtení genů, nikoliv geny samotné. Známe již funkci jedné takové skupiny mnohonásobně přítomných genů. Jsou to geny pro obě velké molekuly ribosomální RNA. Jak jsme již uvedli, tyto molekuly při vzniku nemají správnou délku, ale tvoří se zkrácením společných, velmi dlouhých prekursorových molekul. Prekursory i hotové molekuly ribosomálních RNA nalezneme v jadérku, a rovněž tam nalezneme různá stádia napojování ribosomálních bílkovin na molekuly RNA. Zdá se, že vůbec hlavní funkcí jadérka je vytvářet ribosomu a exportovat je do cytoplasmy. Jadérko se tvoří na určitém chromosomálním úseku a tamnější DNA se nazývá jadérková DNA. U Drosophily a jihoafrické žáby drápnatky byly pozorovány mutace, které se dědí jako Mendelovy faktory a vedou k rozpadu jadérka. V homozygotní formě je nepřítomnost jadérka letální.

Uvažovalo se, že jadérková DNA obsahuje geny pro ribosomální RNA a použitím radioaktivního značení ribosomální RNA to bylo prokázáno hybridizačními pokusy RNA-DNA. Kvantitativní hodnocení těchto hybridizačních pokusů ukázalo, že sledy bází pro obě ribosomální RNA se v jadérkové DNA stonásobně za sebou opakují. Rozdíl proti E.coli je ovšem jen kvantitativní, neboť i tam nalezneme šesti až sedminásobné opakování genů pro ribosomální RNA. Tento rozdíl však ukazuje, o jaké množství informace se musí DNA vyšší buňky postarat. U rostoucích vaječných buněk obojživelníků se proto vytvořil mechanismus k hromadné reprodukci ribosomální RNA, který u baktérií není znám. Můžeme pozorovat vznik velkého množství jadérek. Biochemické sledování ukázalo, že na jadérkové DNA se lokalizovanou syntézou DNA nejdříve vytvoří dceřinné geny, které pak převezmou produkci RNA. Takto založená ribosomální zásoba bohatě postačí i pro mnoho buněčných dělení, k nimž dochází po oplodnění. Pomocné geny pro tvorbu ribosomů se ztratí během dalšího embryonálního vývoje.

DNA pro tvorbu jadérka nepředstavuje tedy jen celou sadu dědičných faktorů stejné funkce, ale může se dokonce v určitých případech stát místem vzniku ještě většího počtu pomocných genů. Z těchto úvah vyplývá, že i úseky DNA, jejichž mutované formy se chovají jako jednoduché Mendelovy faktory, mohou stát organizačně o stupeň výše než geny baktérií.

Nejpádnější důkaz toho, že vyšší buňky představují skutečně vyšší organizační stupeň než bakteriální buňky, byl podán biochemickým sledováním buněčných organel. Největší část DNA vyšších buněk je sice lokalizována v jádře, avšak DNA byla nalezena také v chloroplastech a mitochondriích, tedy v organelách, které tvoří samostatné uzavřené prostory v cytoplasmě. Neplatí vždy, že největší část DNA najdeme v jádře buňky. Zrající buňky obojživelníků obsahují ve své poměrně obrovské cytoplasmatické hmotě tolik mitochondrií, že DNA je v nich více než v jádře. Jsou proto vhodným materiálem pro studium mitochondriální DNA. Tuto DNA tvoří kruhové molekuly a obsahuje asi 15 tisíc párů bází. Živočišné mitochondriální DNA jsou tedy podstatně menší než molekuly DNA bakteriofágů T4 nebo lambda. Mitochondriální DNA, na rozdíl od DNA buněčného jádra, není vázána s histony nebo jinými bílkovinami. DNA mitochondrií a chloroplastů obsahuje genetickou informaci, která však nestačí k výstavbě celé organely. Ve skutečnosti většina bílkovin mitochodrií je kódována geny v buněčném jádře.

Již v době, kdy úloha nukleových kyselin při dědičnosti byla nejasná, se vědělo, že buněčné organely mají určitou genetickou soběstačnost. Při buněčném dělení se nevytváří nové mitochondrie a chloroplasty, ale vznikají rozdělením původních. U rostlin jsou chloroplasty nebo jejich fyziologicky obměněné formy (které nemusí být zelené) většinou předávány potomkům prostřednictvím vaječné buňky, zatímco pyl chloroplasty přenáší zřídka. Koncem 19.století pozoroval Correns, který byl jeden ze spoluobjevitelů Mendelových pravidel, že určité defekty chloroplastů se dědí pouze mateřsky. Jejich způsob dědičnosti neukazoval žádné vyštěpení znaků ve smyslu Mendelových pravidel. Jeho pozorování připouštělo závěr, že dědičné znaky pro pozorované defekty jsou lokalizovány v chloroplastech a že zjištěné poměry zrcadlí jen náhodné rozdělení normálních a defektních chloroplastů mezi potomky.

K podobným závěrům jako u mitochondrií se došlo při genetickém výzkumu kvasinek. Normální kvasinky jsou schopny zkvašovat cukr a přijímat vzdušný kyslík. Zisk chemické energie při příjmu vzdušného kyslíku je vyšší než při kvašení. Přesto však příjem vzdušného kyslíku není pro kvasinky životně důležitý a odstranění kyslíku vede jen ke zpomalení růstu. Velmi často lze nalézt mutanty kvasinek, které rostou pomalu i při přísunu kyslíku, a proto vytváří na agarových plotnách malé kolonie. Biochemický výzkum prokázal, že mnohé z těchto mutant ztratily schopnost příjmu vzdušného kyslíku a že tato ztráta spočívá v defektních mitochondriích. Pokud zkřížíme kvasinky normální a defektní, nezjistíme rozdělení podle Mendelových zákonů. Výsledek lze vysvětlit nerovnoměrným rozdělením defektních mitochondrií mezi potomky, za předpokladu, že mitochondrie nesou defektní dědičný faktor.

V mitochondriích a chloroplastech lze pozorovat syntézu DNA, RNA a bílkovin. Při zkoumání mitochondrií se zjistilo, že obsahují vlastní (buněčným jádrem kódovanou) DNA-dependentní polymerasu RNA, vlastní ribosomy a vlastní molekuly transferové RNA, které se liší od molekul v buněčném jádře a cytoplasmě. Z následující tabulky plyne překvapivá podobnost mezi těmito vlastnostmi v mitochondriích a buňkách baktérií.

Hodnoty S (Svedbergovy jednotky) jsou mírou sedimentace.

Podobné nálezy se zjistily také u chloroplastů a napovídají, že mitochondrie a chloroplasty jsou samostatné organismy uvnitř vyšších buněk. Původně byly podobné baktériím a jejich genom se později zredukoval tak, že ztratily schopnost samostatného růstu. Tyto organismy se vyvíjely od symbiontů k buněčným organelám. V buněčném jádře by se měl nacházet soubor "primitivních" genů, jejichž produkty by syntetizovaly určité bílkoviny, které nejsou buněčné organely schopny samy syntetizovat. Pravděpodobná časná stadia takového vývoje lze pozorovat u určitých amoeb, jejichž cytoplasma vedle mitochondrií obsahuje symbiotické baktérie.

"Vyšší buňka" tedy nese své jméno právem. Její některé organely odpovídají celým bakteriálním buňkám a představují tedy vyšší stupeň organizace.

Jak se vyšší buňky spojují v tkáně? V rostoucím mnohobuněčném organismu se tkáně postupně zvětšují buněčným dělením, a proto bychom se mohli domnívat, že pospojitost podobných buněk v tkáni má "historický" základ a utváří se v průběhu rozvoje organismu. V tomto případě nelze očekávat, že metodami molekulární biologie získáme nějaké závěry o soudržnosti tkání. V protikladu k "historické" hypotéze by mohla stát hypotéza, že buňky mají určitou vlastnost, na jejímž základě se spojují s podobně diferencovanými buňkami. Tato možnost nám připomíná spontánní výstavbu bílkovinných struktur a analogicky je postaven pokus, kterým lze tuto hypotézu ověřit. Buňky diferencované tkáně uměle oddělíme a pozorujeme, zda se spontánně opět spojí, a to pouze s buňkami, které jsou ve stejném stadiu diferenciace.

V jednom pokuse byla ověřena nikoliv tkáňová ale druhová specifita, která existuje při shlukování a spojování buněk. Byly k tomuto účelu vybrány dva příbuzné druhy mořských hub, což jsou zřejmě nejjednodušší mnohobuněčné organismy. Růžová a žlutá houba byly protlačeny jemným sítem a tím byly rozloženy na jednotlivé buňky. Suspenze obou hub byly smíchány. Buňky se shlukly tak, že byly získány čistě růžové a čistě žluté agregáty buněk. To dokazuje, že na povrchu vyšších buněk se nacházejí rozpoznávací místa, která zajišťují soudržnost tkání a mohou ji opět obnovit. Stejný pokus se opakoval pro buňky srdeční a ledvinové tkáně vyšších savců. Srdeční buňky se shlukovaly pouze se srdečními buňkami, ledvinové pouze s ledvinovými. Soudržnost tkáně tedy nespočívá pouze v tom, že se její buňky během vývoje ocitly vedle sebe v sousedství. Jsou dnes důkazy, že specifická rozpoznávací místa obsahují určité glykoproteidy na povrchu buněčné membrány.

V různých oblastech biologie se stále znovu a znovu setkáváme s principem výstavby z podjednotek. Následující tabulka ukazuje sedm stupňů, které jsou přístupné molekulárně biologickému výzkumu.

Lze nalézt smysl toho, proč se v evolučním vývoji prosadil princip podjednotek? O této otázce uvažovali Crane, Watson, Crick a von Caspar. Tyto úvahy lze nejlépe osvětlit na klasickém příkladě struktury složené z podjednotek. Jak bylo uvedeno, virus tabákové mozaiky TMV má obal složený z 200 stejných bílkovinných podjednotek, z nichž každá představuje sled 158 aminokyselin. Pokud by měla být použita jediná obalová bílkovina, obsahovala by více než 300.000 aminokyselin. Genetická informace pro takový polypeptidický řetězec by vyžadovala 900.000 bází v RNA. Takto velká RNA by se ovšem do bílkovinného obalu nevešla. RNA tohoto viru obsahuje pouze 6000 bází a obsahuje kromě genetické informace pro obalovou bílkovinu ještě další informace. Princip podjednotek tedy velmi účinně šetří potřebu RNA. Dále zamezuje, aby se malé chyby projevily fatálně, pokud jde o životně důležité struktury.

Nelze očekávat, že zabudování aminokyselin do rostoucích polypeptidických řetězců probíhá absolutně bez chyb podle pokynů daných sledem bází v RNA. Určité vnější faktory, jako např. antibiotikum streptomycin u baktérií, mohou vést ke zvýšení četnosti chyb při překladu genetické informace. Řekněme, že za příznivých podmínek připadne jedna chyba na 10.000 vestavěných aminokyselin. Ačkoliv je tento podíl tak nízký, pro naši imaginární obří obalovou bílkovinu by výskyt chyb byl fatální: polypeptidický řetězec se 300.000 aminokyselinami by obsahoval průměrně 30 chyb, takže četnost, s jakou by se vyskytl řetězec bez chyby by byla rovna

(1 - 1/10^4)^(3.10^5) = 10^-12

U bílkoviny s řetězcem dlouhým 150 aminokyselin je tato četnost rovna

(1 - 1/10^4)^150 = 0,986

tedy celkem asi 98% případů. Musíme ovšem počítat i s chybami při agregaci podjednotek. Připusťme, že četnost výskytu chyb je opět jedna chyba na 10 000 agregací. Kombinací četností chyb při zabudování aminokyselin a při agregaci dostaneme četnost

(1 - 1/10^4)^150 . (1 - 1/10^4)^2000 = (1 - 1/10^4)^2150 = 0,82

Z malých bílkovinných podjednotek tedy v 82% případů získáme bezchybné bílkovinné obaly viru TMV. Biologické systémy však mají ještě další výhodu z výstavby z podjednotek. Při agregaci se totiž nabízí možnost, jak vyřadit nepodařené podjednotky. Příkladem jsou termolabilní mutanty TMV, u nichž je sled aminokyselin v obalové bílkovině nepatrně pozměněn. Při nižší teplotě vznikají normálně stočené podjednotky. Čím více stoupá teplota, tím více roste podíl podjednotek, které jsou denaturovány a jejich prostorová struktura je neuspořádaná. Virové částice jsou pak sestaveny jen z bezchybných podjednotek. Výběrový proces je velmi účinný vůči chybným podjednotkám. Příklad viru tabákové mozaiky nám tedy ozřejmuje, proč evoluce dala přednost principu výstavby z podjednotek než principu obřích molekul.

                                                                                                 - pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci