Živý organismus se jako celek snaží zajistit všechny své funkce při nejmenší spotřebě energie ve formě ATP. Toho se dosahuje řízením všech biochemických procesů v buňce. Organismy rozvinuly schopnost rozpoznat nabídku energie a stavebních látek a jsou schopny řídit tvorbu a aktivitu enzymů podle této nabídky. K tomu se v buňce používá následujících mechanismů:

- enzymy kontrolují aktivitu enzymů

- malé molekuly kontrolují aktivitu enzymů

- malé molekuly kontrolují určité bílkoviny, které řídí tvorbu enzymů

Uvidíme podrobněji na některých dobře prozkoumaných případech, jak tuto mechanismy fungují. Nejznámější enzymy, které štěpí bílkoviny (proteolytické enzymy, proteasy), jsou trávicí enzymy pepsin, trypsin a chymotrypsin. Při tvorbě proteas v buňkách žaludečních šťáv (pepsinu) nebo slinivce břišní (trypsinu a chymotrypsinu) vzniká problém: jak zabrání buňky žláz, aby jejich stavební bílkoviny nebyly rozštěpeny enzymy, které vyrábějí? V buňkách žláz nejsou produkovány aktivní enzymy, ale pouze inaktivní zymogeny nebo proenzymy. Tyto molekuly obsahují více aminokyselin, než aktivní enzymy a dodatkové členy polypeptidického řetězce nějakým způsobem blokují aktivní centrum enzymů.

V žaludku se vyskytuje kyselina chlorovodíková, která odštěpí u několika molekul pepsinogenu šest různých peptidů. Vzniklý pepsin pak napadne ostatní molekuly pepsinogenu a přemění je v pepsin. V buňkách žláz, kde se vytváří pepsinogen, nemůže tento proces probíhat, protože v nich není silně kyselé prostředí.

Inaktivní trypsinogen, vytvářený ve slinivce břišní, přichází do tenkého střeva, kde proteasa odštěpí peptid o struktuře

val - asp - asp - asp - asp - lys.

Tím se trypsinogen přemění v aktivní trypsin, který odštěpí blokující peptid u dalších molekul trypsinogenu. Již dříve bylo uvedeno, že trypsin štěpí bílkovinné řetězce tam, kde se nachází zásaditá aminokyselina lysin nebo arginin. Trypsin dále přemění inaktivní chymotripsinogen v chymotripsin. Aktivace enzymů pepsinu a trypsinu je biologickým příkladem pozitivní zpětné vazby. V biochemii se tento proces označuje jako autokatalýza. Lavinovitě vzniká tím více aktivních molekul, čím více je jich přítomno. Organismus využívá tohoto principu, aby bez velké časové ztráty byl schopen reagovat na náhlou nabídku živných látek. Vzestup tvorby aktivních proteas má svou horní mez danou množstvím inaktivních proenzymů.

Fibrin a trávicí enzymy jsou příkladem toho, že syntetizované makromolekuly musí být ještě přizpůsobeny, než se stanou biologicky aktivní formou. Podobně oba řetězce insulinu vznikají vytržením části řetězce z prekursorové molekuly proinsulinu, která má jen jeden polypeptidický řetězec. V posledních letech se ukázalo, že tento princip se vyskytuje zcela běžně a to nejen u polypeptidických řetězců, ale také u nukleových kyselin. Například obě velké ribosomální ribonukleové kyseliny jsou odštěpeny ribonukleasami z jediné prekursorové makromolekuly.

Jiná metoda, jak lze v případě potřeby aktivovat enzymy, byla objevena při výzkumu metabolismu glukosy u savčího organismu - viz příloha 8.A. Při velké nabídce glukosy se rozpustná glukosa přemění v nerozpustný glykogen. Glykogen se skládá z rozvětvených řetězců glukosových molekul. Ukládá se převážně v játrech. Při zvýšené spotřebě energie, např. při namáhavé svalové práci, signalizují hormony adrenalin a glukagon játrům, aby se provedla zpětná přeměna. Složitým řetězcem biochemických signálů dochází k aktivaci enzymu, který štěpí glykogen na glukosu. Při této aktivaci se spotřebovává ATP a fosfátové skupiny se přenesou na některé postranní řetězce aminokyselin serinu v inaktivní molekule enzymu. Fosforylovaný enzym je aktivní a štěpí glykogen. V tomto případě se tedy k molekule enzymu připojuje určitá molekula a tím je enzym aktivován. Současně zde máme příklad, jak hormony mohou zasahovat do biochemických procesů organismu.

Buňky mikroorganismů jsou mnohem závislejší na měnících se vnějších podmínkách, než vnitřní orgány vyšších živočichů,které jsou chráněny mechanickými a chemickými bariérami. Proto baktérie vytvořily mnoho molekulárních regulačních mechanismů. Mimo to jsou baktérie obzvláště vhodné objekty, na nichž lze tyto regulační mechanismy studovat.

Jako ukázka působení zpětné vazby může posloužit uzavřený systém králíků a lišek. Pokud je králíků mnoho, lišky mají dostatek potravy, množí se a požírají více králíků. Počet králíků poklesne, tím lišky trpí hlady a vymírají. Jakmile je méně lišek, králíci se opět začnou množit a cyklus se opakuje.

Velmi podobným způsobem reagují baktérie na nabídku živných látek z vnějšího prostředí. Regulace vlastní produkce směřuje k tomu, aby se vytvářely molekuly, které jsou zapotřebí a jichž je ve vnějším prostředí nedostatek. Současně se musí zastavit produkce stavebních látek, které jsou již přítomny ve značném množství. Biochemické reakce malých molekul mohou být brzděny tím, že příslušné enzymy jsou blokovány anebo nejsou nově vytvářeny. U mikroorganismů se uplatňují oba principy. Promluvíme nejprve o rychle působící a jemně odstupňované kontrole aktivity již přítomných enzymů.

Tato regulace syntézy malých molekul byla objevena v roce 1956 při tvorbě aminokyseliny isoleucinu. Tvorba malých molekul probíhá celou řadou mezistupňů a každá reakce je katalyzována specifickým enzymem. Řetězová syntéza isoleucinu vychází z aminokyseliny threoninu. Probíhá čtyřmi mezistupni a potřebuje tedy pět enzymů:

Thre ----> A ----> B ----> C ----> D ----> Ileu

                    E1         E2      E3        E4        E5

Pokud baktériím nabídneme isoleucin v živném médiu, celá syntéza se zastaví. Netvoří se ani isoleucin, ani jeho předstupně A, B, C a D. Z buněk byly připraveny extrakty obsahující enzymy a bylo zjištěno, že isoleucin inhibuje enzym E1, ale ne ostatní enzymy. Při inhibici enzymu E1 se syntéza zastaví, protože další enzymy nedostanou substráty. Protože enzym E1 je inhibován konečným produktem syntézy, kterou zahajuje, nazýváme tento druh regulace "inhibice konečným produktem". Tato inhibice je vratná. Pokud odstraníme z živného média isoleucin, sníží se jeho koncentrace v buňce a zablokovaný enzym E1 se stane aktivním.

Jaký je mechanismus inhibice konečným produktem? Přijatelná myšlenka může být tato: když konečný produkt dosáhne určité koncentrace, zablokuje aktivní centrum enzymu, na které se zachycuje molekula substrátu. V našem případě má substrát enzymu E1 threonin některé podobné vlastnosti jako konečný produkt isoleucin. U jiných řetězových syntéz se stejným regulačním mechanismem však první substrát a konečný produkt nemají žádné společné vlastnosti. Protože je známo, že aktivní centrum představuje zcela přesně tvarovanou prohlubeň v makromolekule enzymu, která přijímá jen zcela určité molekuly, je tento způsob vysvětlení mechanismu inhibice značně nepravděpodobný. Přesto však bylo zjištěno, že k inhibici dochází skutečně vazbou, ikdyž nepříliš pevnou, konečného produktu na první enzym. Vědci pracovní skupiny shromážděné kolem Monoda se snažili vysvětlit obě tyto skutečnosti a navrhli koncepci alosterie (prostorové změny). Podle této koncepce se substrát a inhibitor navazují na různých místech enzymové makromolekuly. Začlenění inhibitoru do jeho vazebního místa natolik pozmění prostorovou strukturu enzymu, že aktivní místo substrátu se uzavře.

Prokázání této hypotézy je obtížné, ale přesto získala podporu. Hypotéza zahrnula ještě další myšlenku, a to tzv. "molekulárního posílení". Pro organismus je zřejmě výhodné, aby se při změnách v koncentraci malých molekul rozhodl buď pro jejich syntézu nebo proti syntéze. Monod a jeho kolegové si představovali, že z tohoto důvodu by regulační enzymy mohly být agregáty nebo malé krystaly, složené z identických enzymových podjednotek, které jsou natolik směstnány, že všechny podjednotky musí mít stejný tvar. Tímto způsobem by jejich chování bylo podřízeno určitému molekulárnímu rozhodnutí většiny. Když se inhibitor naváže na vícero podjednotek, přinutí tyto molekuly i ostatní molekuly k zaujmutí inaktivní formy a celá soustava tak bude inaktivní. Když klesne koncentrace inhibující látky pod kritickou hodnotu, uvolní se tím několik naposledy navázaných molekul inhibitoru, takže většina podjednotek enzymu přinutí ostatní molekuly, aby přešly v aktivní formu.

Tyto úvahy by zůstaly myšlenkovou hrou, pokud by je nebylo možno ověřit fyzikálními metodami. Úvahy se potvrdily nikoliv na enzymu, ale na transportní bílkovině hemoglobinu. Pracovní skupina Perutze prokázala, že makromolekula hemoglobinu se skládá ze čtyř podobných podjednotek. Při navázání kyslíku makromolekula reaguje změnou tvaru, zmenší svůj objem. Při odevzdání kyslíku naopak svůj objem zvětšuje. Každá podjednotka hemoglobinu obsahuje skupinu hemu, jejíž centrální atom železa váže molekulu kyslíku - viz příloha 6. Na jednu makromolekulu hemoglobinu se může navázat jedna až čtyři molekuly kyslíku. Pokud roztoku hemoglobinu nabídneme stoupající koncentraci kyslíku, pozorujeme nejprve velmi slabou vazbu, potom však náhlý vzestup množství vázaného kyslíku, kdy dojde k vazbě čtyř molekul kyslíku na jednu makromolekulu hemoglobinu. Hemoglobin tedy nejlépe zaujímá stav bez molekul kyslíku nebo se čtyřmi molekulami kyslíku. Chová se tedy přesně podle úvah alosterického "rozhodnutí". To, že jeho chování skutečně spočívá na spoluprácí čtyř podjednotek prokážeme jeho srovnáním s molekulou myoglobinu, která obsahuje jediný polypeptidický řetězec a s rostoucí nabídkou kyslíku jeho vazba stoupá rovnoměrně.

Když byly zveřejněny tyto výsledky rentgenové strukturální analýzy, ukázalo se, že obdobné závěry bylo možno udělat již na základě starých pozorování, provedených zcela jednoduchými metodami, neboť hemoglobin tvoří různé krystalické formy podle toho, zda má navázaný kyslík nebo nemá. Jak již víme, v krystalické formě se odrážejí molekulární vlastnosti, jako je změna tvaru molekuly.

Myšlenku alosterie lze použít také v jiných případech. To, že bílkoviny mohou vazbou určitých malých molekul změnit svůj stav, nám dává možnost vysvětlit, jak účinkují bílkoviny svalu, bičíků a kontraktilní bílkovinné obaly některých bateriofágů.

Regulace aktivity již přítomných enzymů umožňuje buňkám, aby rychle a jemně reagovaly na změny vnějšího prostředí. Přesto však není příliš ekonomické, když se v buňce vybuduje složitý aparát a udržuje se pro případy, které mohou nastat jen zřídka. Bylo by zřejmě výhodnější, kdyby se příslušný aparát vybudoval až v okamžiku jeho potřeby, za což se bude muset ovšem zaplatit časově zpožděnou reakcí.

U buňky to znamená, že neustále nesyntetizuje všechny enzymy, které je schopna utvářet. Vždyť syntéza nadbytečných enzymů je energeticky náročný proces, neboť aminokyseliny, z nichž jsou stavěny, jsou cenné malé molekuly a jejich vytváření a spojování vyžaduje další chemickou energii. U buněk vyšších živočichů a rostlin zcela zřejmě existuje kontrola nové tvorby enzymů a jiných bílkovin. Ačkoliv všechny tělní buňky obsahují ve své chromosomální DNA stejnou genetickou informaci, při proteosyntéze se výrazně specializují. Trávicí enzymy jsou vytvářeny jen v buňkách pankreatu, hemoglobin je vytvářen jen v červených krvinkách, bílkovina keratin vzniká jen v kožních buňkách. U rostlin je specializace méně rozšířena, avšak pozorujeme výrazné rozdíly mezi bílkovinami v listech, kořenech a semenech. Zatím pouze u baktérií byly objasněny mechanismy, kterými buňky proteosyntézu kontrolují.

Když má baktérie Escherichia coli růst na mléčném cukru laktose (viz příloha 3.) jako jediné organické živné látce, potřebuje nejméně dva enzymy: permeasu laktosy, která zatím neobjasněným způsobem zajišťuje transport mléčného cukru v buňce (a kterou bychom měly označovat za transportní bílkovinu) a beta-galaktosidasu, která štěpí disacharid laktosu na její dvě cukerné složky, galaktosu a glukosu. Enzym odštěpuje zbytky, které jsou na galaktosu vázány v poloze beta. Těmito zbytky nemusí být jen cukry, ale jsou odštěpovány také glycerol a ethanol. Glukosa se zapojuje do běžného metabolismu (viz příloha 8.A), kdežto galaktosa se musí nejdříve enzymatickým systémem převést na glukosu. V tomto případě nás zajímá pouze tento systém.

Pokud necháme kulturu E.coli růst na směsi glukosy a laktosy, buňky zcela ignorují laktosu až do té doby, dokud nejsou všechny molekuly glukosy vyčerpány. Potom se zastaví růst celé kultury a za několik minut začne opět probíhat spotřebovává se laktosa. Kdyby některé buňky odbourávaly laktosu, dokud je nabízena snadno odbouratelná glukosa, utrpěly by v konkurenčním boji určitou nevýhodu. Proto buňky vyčkávají s výstavbou náročného enzymatického aparátu až do doby, než jej skutečně potřebují. Tento mechanismus se ovšem vykoupí zpožděnou schopností reagovat, neboť výstavba enzymatického aparátu vyžaduje vždy několik minut, zatímco aktivace již vytvořeného enzymu je možná bez časové ztráty. To, že v případě laktosových enzymů jsou tvořeny nové enzymatické bílkoviny a nikoliv aktivovány již přítomné proteoenzymy, se samozřejmě muselo prokázat biochemickými technikami. Když se tak stalo, měli badatelé k dispozici systém, na kterém mohli dále zkoumat kontrolu proteosyntézy.

Některé charakteristické rys tohoto modelu bylo možné vyčíst již z jednoduchého růstového pokusu. Genetická informace pro laktosové enzymy musí být přítomna v bakteriální DNA, avšak něco brání této informaci v její realizaci, pokud buňka může růst bez laktosy. Laktosa může zřejmě indukovat tvorbu enzymů, avšak tato indukce je inhibována, dokud je současně přítomna glukosa. Za model mechanismu a za jeho prokázání vděčíme pracovní skupině Monoda z Pasteurova ústavu v Paříži.

Nejdříve se podařilo potvrdit představy o indukci. Jak beta-galaktosidasa, tak i permeasa se tvoří teprve v přítomnosti laktosy. Musí tedy jít o případ zpětné vazby. Několik molekul laktosy, které i bez pomoci permeasy vniknou do buňky, vyvolá mimo jiné syntézu permeasy a tím zesílený přísun laktosy do buňky. Vedle permeasy a beta-galaktosidasy se indukuje syntéza enzymu transacetylasy, kterou se však nebudeme dále zabývat. Podstatné je, že tvorba tří bílkovin podléhá zřejmě stejnému kontrolnímu mechanismu. Brzy se zjistilo, že indukci lze vyvolat velkým množstvím chemických sloučenin, jejichž chemická struktura však musí být příbuzná beta-galaktosidu. Zejména zajímavé byly ty induktory, u kterých byla beta-vazba přes atom síry a nikoliv přes atom kyslíku. Takové sloučeniny mají téměř stejnou strukturu jako beta-galaktosidy, ale nemohou být beta-galaktosidasou odštěpeny a nejsou tedy živnými látkami. Pomocí těchto látek, které se v přírodě nevyskytují, se podařilo osvětlit regulační mechanismy E.coli. Enzymy, které se při tom indukovaly, neměly v tomto případě žádnou funkci. Tyto pokusy prokázaly, že indukce nemá nic společného s využíváním malých molekul při látkové výměně. Indukce je vyvolána výlučně speciálním regulačním systémem.

Genetikové identifikovali regulatorní gen R, na jehož funkci závisí indukovatelnost syntézy enzymů. U mutanty, defektní v tomto genu, se příslušné tři enzymy vytvářely i bez induktoru, a došlo tak ke ztrátě kontroly enzymové syntézy. Určitými genetickými triky se podařilo do téže buňky vpravit funkčně neschopný gen R- a funkčně schopný gen R+. U vyšších organismů s dvojí sadou chromosomů by se tohoto cíle dosáhlo jednoduchým křížením. Ve smyslu klasické genetiky se lze ptát: která vlastnost je dominantní: R+ nebo R-? Dominantní je vždy ta forma genu, která vytváří aktivní produkt. V pokuse s laktosovým regulatorním genem E.coli se prokázalo, že R+ je dominantní nad R-. Hybridní buňky totiž netvořily v nepřítomnosti induktoru žádné laktosové enzymy, tak jako kdyby obsahovaly pouze gen R+. Blokace syntézy je tedy pozitivním výkonem genu R. Bylo také prokázáno, že gen R účinkuje na určité vzdálenosti v cytoplasmě. V tomto pokuse byl gen R+ a enzymové geny zavedeny na různé bakteriální chromosomy, na episom a hlavní chromosom. Mimo to i v normálním případě buňky E.coli divokého typu leží gen R v určité vzdálenosti od enzymových genů, které sami o sově tvoří uzavřenou skupinu. Následující schéma ukazuje, jak asi vypadá genová mapa laktosové oblasti chromosomu E.coli.

|============|---||---|=|--|========|-|========|-|========|--

                    (0)                (1)   (2)         (3)              (4)                   (5)

(0) - represorový gen, (1) - startovní bod pro enzymové geny, (2) - vazebné místo pro represor, (3) - beta-galaktosidasa, (4) - permeasa, (5) - transacetylasa

Dálkové působení regulatorního genu lze vysvětlit tak, že tento gen řídí syntézu produktu, který difunduje cytoplasmou a v nepřítomnosti induktoru blokuje enzymové geny. Tato látka byla Monodem a jeho kolegy označena jako represor.

Na základě pokusů vznikl určitý obraz o jeho účinku. Čtení enzymových genů začíná společně z určitého výchozího bodu (1). Čtení zajišťuje DNA-dependentní polymerasa RNA a přitom vzniká informační RNA pro enzymové bílkoviny. Vedle startovního bodu pro polymerasu RNA je DNA specifická oblast, na kterou se navazuje represor, a to v případě, když není k dispozici žádný induktor. Represor zabraňuje polymerase RNA vykovávat funkci a tím brání tvorbě enzymů. Molekula represoru má však nejen vazebné místo pro DNA, ale má také místo pro navázání molekuly induktoru. Pokud je induktor k dispozici, umístí se na toto vazebné místo a změní represor tak, že se nemůže vázat k DNA. Tím se uvolní prostor pro polymerasu RNA a začne syntéza informační RNA pro syntézu enzymů. Brzy se získalo několik nepřímých důkazů, že represor musí být bílkovina.

Na laktosovém systému byly rozvinuty základní myšlenky o regulaci proteosyntézy. Laktosové enzymy by však mohly být ojedinělým případem. Zúčastní se při odbourání jediné živné látky, dodávané zvnějšku. Jak jsou však regulovány enzymy, které budují látky tělu vlastní? Jak jsme již popsali, takové enzymy podléhají často inhibici konečným produktem. Zjistilo se však, že i u těchto enzymů se kontroluje nejen jejich aktivita, ale také novotvorba. Když nabízíme buňce v živném médiu dostatek tryptofanu, ustane nakonec novotvorba enzymu, který syntetizuje tryptofan. Ukázalo se, že tuto regulaci provádí opět represor. Zatímco však v laktosovém systému je represor inaktivován malou molekulou laktosy (nebo jinou molekulou působící jako induktor), účinkuje tryptofan na represor tryptofanu systému aktivujícím způsobem.

Společně regulované enzymové geny jsou ve většinou sdruženy ve skupině a pro všechny enzymy je syntetizována společná molekula informační RNA. Jediná informační RNA obsahuje tak pokyn pro tvorbu více bílkovin, jak jsme již poznali u RNA-virů.

Podobně činnost bakteriofágů lambda lze vysvětlit hypotézou represoru. Fág lambda se může chovat agresivně a hostitelská buňka vytvoří již asi za hodinu více než sto fágových částic. Hostitelská buňka nakonec praskne a uvolní fágové částice a "lytický" (rozpouštějící) životní cyklus fágu je uzavřen. V mnoha případech však proběhne lysogenní infekční cyklus, který rozpouštění buňky vyvolává jen příležitostně. Fágová DNA se zabuduje do bakteriálního chromosomu a zmnožuje se stejným rytmem jako bakteriální DNA při buněčném dělení. Nové fágové částice se netvoří. Někdy dojde náhle k tomu, že v buňkách vzniknou fágové částice. André Lwoff z Pasteurova ústavu objevil, že tento proces lze vnějšími podněty indukovat. Když baktérie, které jsou lysogenní pro lambda fágy, ozáříme malou dávkou ultrafialového světla, vyvoláme téměř na všech buňkách tvorbu fágových potomků. Prakticky tím usmrtíme celou populaci bakteriálních buněk. Stejná dávka ultrafialového světla nemá téměř žádný vliv na zdravé bakteriální buňky.

Fágové geny, které jsou nezbytné pro tvorbu nových fágových částic, jsou zřejmě v lysogenních buňkách blokovány. Náhodnými vlivy dojde ke zrušení blokace. Kontrolu nad fágovými geny vykonává molekula, která se vyskytuje v cytoplasmě lysogenních buněk. Jestliže se totiž pokusíme infikovat lysogenní buňku znovu fágy lambda, syntéza nové fágové DNA je ihned zastavena. Byly nalezeny také mutanty fágů lambda, u kterých tato kontrola zanikla v důsledku genetického defektu. Takové mutanty mají pouze lytický životní cyklus. Všechny tyto nálezy lze vysvětlit společným mechanismem za předpokladu, že samotný fág vytváří represor, který vyřadí ostatní fágové geny, sloužící k produkci potomků. Za určitých vnějších vlivů se účinek represoru zruší a uvede se do chodu syntéza fágů.

Teprve v 70.letech 20.století se podařilo v chemicky čisté formě izolovat laktosový represor a represor lambda. Různými metodickými triky byly překonány nesnáze technických postupů, dané nesmírně malým množstvím hledané látky. Jak se očekávalo, vyčištěné represory byly bílkoviny. Vazba induktoru na laktosový represor a vazba represoru na specifická místa DNA byly experimentálně potvrzeny.

Vedle katalytické aktivity a schopnosti tvorby nových struktur tedy existují bílkoviny s regulační schopností.

Regulační mechanismus přitom nezasahuje až při proteosyntéze na ribosomech, ale již při tvorbě informační RNA na matrici genové DNA. O tom, zda nastal případ potřeby, rozhodne přítomnost určitých malých molekul, které se navazují na specifické regulační bílkoviny a tím je aktivují. Regulační bílkoviny vykonávají svou funkci tak, že DNA-dependentní polymerase RNA umožní nebo neumožní čtení určitých genů. V této obecné formulaci je obsažena také možnost pozitivní kooperace mezi regulační bílkovinou a RNA-polymerasou, nikoliv jen negativní, brzdící účinek represorů. Tím se naše regulační schéma zobecňuje.

Když se zjistilo, že k regulaci dochází na úrovni transkripce a nikoliv translace, dostala se DNA-dependentní polymerasa RNA opět do středu zájmu, protože zřejmě tento enzym rozhoduje o tom, které geny se budou realizovat. Podíváme se ještě jednou na laktosové geny: ikdyž je induktor přítomen a tím represor uvolní cestu polymerase RNA, musí se molekula polymerasy ještě zachytit na výchozím bodě na DNA, pokud má skutečně dojít k přepisu informace. Viděli jsme, že v případě laktosového genu k tomu nedochází ani v přítomnosti induktoru laktosy, pokud je současně přítomna glukosa, tedy živná látka, které se dává přednost. Teprve nedávno byl do jisté míry vysvětlen mechanismus této regulace. Hraje při ní úlohy pozitivně účinkující regulační protein, k jehož aktivitě je zapotřebí molekuly c-AMP (cyklického adenosinmonofosfátu - viz příloha 7.). Tato molekula vzniká v buňce tehdy, když v celkovém metabolismu je nedostatek energie. Teprve při výskytu této molekuly nastane indukce enzymů, které odbourávají cukry. Pokud je však přítomen dostatek glukosy, cyklický AMP se netvoří a nedojde k indukci enzymů pro těžko odbouratelné druhy cukrů.

Začátkem 80.let 20.století se zjistilo, že v komplexní molekule DNA-dependentní polymerasy RNA je přítomen polypeptidický řetězec, který se označuje "sigma" a který přivádí polymerasu na správné začátky genů na molekule DNA. Bez tohoto faktoru sigma může sice enzym řídit syntézu RNA na matrici DNA, avšak vzniklá RNA je neuspořádanou směsí molekul, u kterých nejsou pevně stanoveny začátky.

Objev bílkoviny sigma poprvé podpořil myšlenku, že v organismu dochází k programování genových aktivit. Vědci se domívali, že by mohly existovat různé bílkoviny sigma, které by byly specifické pro určité skupiny začátků genů. Přítomnost určitého faktoru sigma by pak rozhodovala o tom, které geny budou právě čteny.

Tato představa byla poprvé doložena experimentálně ve dvou případech u baktérií. Jeden případ je buňka Escherichia coli, nainfikovaná DNA-bakteriofágy typu T4, a to tehdy, když okamžitě dojde k produkci nových fágů a buňka je rozpuštěna. Máme zde příklad úplné změny programu bakteriální buňky během několika minut. Zastaví se vlastní syntéza RNA a bílkovin a celý aparát buňky se přeorientuje na tvorbu informační RNA a bílkovin fágu. Zjistilo se, že tento přechod je ve skutečnosti vyvolán tvorbou nového faktoru sigma, který je fágově specifický. Tento nový faktor sigma nahradí buněčně specifický faktor a způsobí, že polymerasa RNA hostitelské buňky již nerozpozná vlastní DNA a místo toho začne číst geny na fágové DNA.

Zdá se, že změna orientace prostřednictvím faktorů sigma se neuplatňuje jen v patologickém případě buňky napadené virem. U určitých druhů baktérií dochází při vyčerpání živného média k tvorbě spor, a to je spojeno s radikální změnou látkové přeměny. Při tvorbě spor se zastaví biochemické procesy zaměřené na růst a buněčné dělení a buňka se specializuje na uložení zásobních látek a na vybudování pevného ochranného obalu. Přirozeně pro tyto úkoly je třeba zcela odlišných enzymů a strukturálních bílkovin. Zjistilo se, že tento zvrat je vyvolán novým faktorem sigma, který zřejmě odvede DNA-dependentní RNA polymerasu k nové skupině genů.

Spoluobjevitel struktury DNA, James Watson, otevírá ve své knize "Molekulární biologie genů" zajímavou možnost, že pouhou výměnnou různých faktorů sigma mohou být předem programovány časové rozvrhy vývoje buňky. Pokud předpokládáme, že polymerasa RNA je přímo svázána s faktorem sigma-I, začíná číst na určitém startovním bodě skupinu genů třídy I. Toto čtení, tedy spojování stavebních částí RNA na matrici DNA, potřebuje určitý čas. Na konci genové skupiny I přijde gen, podle něhož se vytvoří faktor sigma-II. Jakmile faktor sigma-II dosáhne určité koncentrace, vytlačí faktor sigma-I z polymerasy RNA a odvede enzym ke skupině genů třídy II.

To nás vede k otázce, jak jsou uvedené kontrolní mechanismy realizovány u vyšších organismů. Můžeme si představit, že podobným způsobem probíhá vývoj živočicha z vajíčka, eventuálně různými stádii larev až k dospělému jedinci? Ukáže se, že víme sice mnoho o struktuře a aktivitě enzymů i jiných bílkovin vyšších organismů, ale naše znalosti regulace tvorby těchto bílkovin jsou u vyšších organismů jen nepatrné. Můžeme předpokládat, že i v embryonálním vývoji živočichů existuje časová kontrola tvorby různých bílkovin. Obří chromosomy much a komárů poskytly první důkazy o tom, jak se taková regulace uskutečňuje. Zabudováním radioaktivně značených prekursorů RNA do buněk a autoradiografií obřích chromosomů se zjistilo, že již tvorba RNA na chromosomu sleduje určitý časový plán. Velmi nadějný výsledek získala pracovní skupina v Tubingen, která zjistila, že hmyzí hormon ecdyson ovlivňuje plán tvorby RNA na obřích chromosomech u larev much. Byl to tedy příklad toho, jak hormonu ovlivňují aktivitu určitých skupin genů.

Od poznání, že nukleová kyselina je nositelkou dědičné informace až k analýze genetických regulačních procesů jsme sledovali jednu základní myšlenku: životní pochody lze chápat jako reakce mezi malými molekulami a makromolekulami a jako vzájemné reakce mezi makromolekulami. Dědičnost, metabolismus a nejjednodušší případy výstavby tvarů lze uspokojivě vysvětlit v rámci molekulární biologie. O některých dávných problémech klasické biologie jsme se zmínili jen letmo: jde například o boj o přežití, omezení individua, vývoj druhů živých organismů nebo lidské choroby. V dalších kapitolách nás budou zajímat výsledky, k nimž lze dojít metodami molekulární biologie.

Ve vzájemném boji organismů hraje úlohu nejen parazitismus a získávání kořisti, ale také biochemické zbraně. Mikroorganismy často vypouštějí do svého okolí jedovaté látky a tím se brání před svými protivníky. V průběhu vývoje druhů se však vůči mnoha těmto jedům vytvořily obranné mechanismy, které vedou k rezistenci. Mimo to musely především mikroorganismy vyvinout obranná zařízení proti fyzikálním vlivům, kterým mohou nesnadno unikat.

V minulých kapitolách jsme se již několikrát setkali s antibakteriální látkou vytvářenou vyššími organismy. Jednou z těchto látek je enzym lysozym, který se u člověka vyskytuje například v slzách a nosním hlenu. Obzvláště ve velké koncentraci se nachází ve vaječném bílku. Tento enzym působí proti baktériím tím, že rozpouští molekulární kostru bakteriální buněčné stěny.

Lysozym objevil Alexander Fleming v roce 1922. V roce 1929 objevil další antibakteriální látku, která se stala jedním z velmi významných prostředků medicíny.

Fleming pozoroval, že určitá plíseň, která se při nesterilní práci velmi rozrostla na jeho bakteriálních plotnách, byla obklopena jasným okolím, ve kterém se baktérie nemohly množit. Plísňová houba uvolňovala látku, která difundovala do agaru a usmrtila baktérie nebo zabránila jejich růstu. Bylo tak objeveno první antibiotikum - penicilin.

Jedovatý účinek penicilnu se nejsilněji uplatní za dobrých růstových podmínek. Klidovým bakteriálním buňkám penicilin neškodí. Není jedovatý pro vyšší organismy, ikdyž u nich může vyvolat alergickou reakci. Dnes již známe dobře mechanismus jeho účinku. Základní molekulární kostra bakteriální buněčné stěny je držena pohromadě hlavními chemickými vazbami. Bakteriální buňka při svém růstu postupuje tak, že určité buněčné štěpící enzymy oddělují ohraničené skupiny řetězových molekul a syntetické enzymy vsunují nové členy řetězce. Práce syntetických enzymů je blokována penicilinem, zatímco štěpící enzymy dále rozrušují buněčnou stěnu. Osmotický tlak v buňce způsobí prasknutí rozrušení buněčné stěny. V klidových buňkách jsou enzymy, které rozrušují buněčnou stěnu, inaktivní, a penicilin nemůže stěnu nijak poškodit.

Stafylokoky vyvinuly proti penicilnu obrannou zbraň. Vytvářejí enzym penicilinasu, která štěpí a deaktivuje molekulu penicilinu. Penicilinasa stafylokoků je indukovatelný enzym a je vytvářen v případě potřeby. Syntéza enzymu je vyvolána teprve přítomností penicilinu v médiu. Jde o velmi komplexní obranný systém, kdy specifický enzym a příslušný regulační aparát jsou namířeny proti jediné jedovaté látce.

Mnohá jiná antibiotika zasahují do řetězce procesu syntézy, který je nezbytný při předávání a využití dědičné informace. Následující tabulka obsahuje seznam antibiotik, o kterých budeme mluvit v této kapitole a některých dalších jedů působících na buňky.

Mitomycin se přeměňuje v buňce v reaktivní molekulu, která reaguje s DNA a propojuje oba prameny, čímž zabraňuje replikaci DNA. Zřejmě také uvede do chodu reparační (opravné) mechanismy, které nepracují vždy bez chyby a tímto způsobem vyvolává mutace. Tak jako aktinomycin, i mitomycin působí výrazně na rychle se dělící buňky a proto se používá při terapii rakoviny. Jak lze očekávat podle jeho mechanismu působení, není účinek omezen jen na nádorové buňky a proto je tato terapie doprovázena poškozením organismu.

Aktinomycin se vsouvá mezi páry bází dvoušroubovice DNA, aniž tvoří s DNA pravé chemické vazby. Již v nízkých koncentracích blokuje DNA-dependentní polymerasu RNA a tím syntézu informační, ribosomální a transferové RNA.

Protože aktinomycin se váže na DNA, měl by být toxický pro všechny organismy. Ale mnohé baktérie, jako E.coli, jsou vůči němu rezistentní, protože aktinomycin nemůže projít jejich buněčnou stěnou.

Stejně jako aktinomycin, také rifamycin blokuje DNA dependentní syntézu RNA. Rifamycin však neblokuje matrici DNA, ale váže se na polymerasu RNA a zabraňuje jí vytvářet nové řetězce RNA. Zatímco struktura DNA je univerzální, je struktura enzymu DNA-dependentní polymerasy RNA u různých organismů různá. Polymerasa RNA vyšších buněk není rifamycinem inhibována, proto se rifamycin používá v medicíně. Některé baktérie se ubrání účinku rifamycinu tím, že se struktura jejich polymerasy RNA pozmění mutací.

Jedním z nejprudších jedů pro teplokrevné organismy je amanitin, nacházející se v muchomůrce hlíznaté [Amanita phalloides]. Bezprostřední účinek jedu spočívá v rozpouštění červených krvinek. Biochemických zkoumáním se zjistilo, že amanitin inhibuje DNA-dependentní syntézu RNA tím, že působí na polymerasu RNA v buněčném jádru.

Aktinomycin a rifamycin se používá v molekulárně biologickém výzkumu. Pomocí nich lze zjistit, zda DNA-dependentní syntéza RNA je nezbytná při určitých biochemických procesech v buňce. Lze například těmito jedy blokovat tvorbu indukovatelných enzymů, neboť předpokládá vznik informační RNA. Replikace RNA-virů, např. RNA-fágů, polioviru nebo viru tabákové mozaiky však není inhibována, neboť při ní nehraje úlohu ani matrice DNA, ani buněčně specifická polymerasa RNA. Použitím těchto jedů lze dobře prozkoumat pomnožovací cyklus RNA-virů, pokud potlačíme vlastní syntézy v buňce.

Do proteosyntézy zasahuje mnoho antibiotik. Pozoruhodný mechanismus účinku mají puromycin a streptomycin. Připomeňme si nejprve základní procesy při syntéze bílkovin. K informační RNA se připojují ribosomy, které se skládají s podjednotek 30S a 50S. Na informační RNA se objevují postupně triplety bází, určující, jaké aminokyseliny se mají napojovat k polypeptidickému řetězci. Rozpoznání tohoto tripletu se provádí prostřednictvím molekul transferových RNA, které přenášejí různé aminokyseliny. Když transferová RNA dopraví aminokyselinu na její místo v rostoucím řetězci, splní tím svoji funkci a uvolní se.

Účinek puromycinu spočívá v napodobení činnosti transferové RNA, protože má s touto molekulou strukturální podobnost. Ve skutečnosti dojde také k vazbě mezi aminokyselinovou částí puromycinu a rostoucím polypeptidickým řetězcem. Tím se syntéza řetězce zastaví, protože proteosyntetické enzymy nemohou odštěpit zbytek puromycinu. Místo úplného polypeptidického řetězce vznikne pouze jeho část, na jehož konci je navěšen puromycin.

Streptomycin zpomaluje proteosyntézu a způsobuje zabudování chybných aminokyselin do polypeptidických řetězců, které jsou syntetizovány v jeho přítomnosti. Chybně sestavené bílkoviny pak pozbývají svých biologických funkcí a částečně nebo úplně se zastaví procesy v buňce. V systému "in vitro" (ve zkumavce) se prokázalo, že v přítomnosti streptomycinu vznikají při překladu informační RNA chyby ve čtení. Umělá informační RNA poly-UG vede za normálních podmínek k syntéze řetězce obsahujícího cystein a valin:

U G U--G U G--U G U--G U G

    cys       val        cys        val

V přítomnosti streptomycinu se však do řetězce zabuduje také arginin a serin. Uvažuje se, že streptomycin způsobuje deformaci ribosomů a tím dochází k chybám čtení. Mutací se mohou bakteriální kmeny citlivé na streptomycin stát rezistentními. Tuto rezistenci lze prokázat i s buněčnými extrakty ve zkumavce. Není tedy způsobena nepropustností buněčné stěny, ale pozměněnými ribosomy. Pomocí těchto mutant bylo ještě přesněji určeno místo, kde účinkuje streptomycin. Ribosomy z citlivého a rezistentního kmene byly opatrně rozloženy na podjednotky 30S a 50S. Tyto podjednotky byly v centrifuze odděleny a potom křížově spojeny. Tyto hybridní ribosomy pak byly testovány ve zkumavce. Výsledek pokusu byl následující.

Z výsledků plyne, že streptomycin zřejmě zasahuje na podjednotce 30S.

Kromě antibiotik, které zasahují do syntéz, existují také jedy, které ruší funkci strukturálních bílkovin.

Kolchicin je jed z ocúnu jesenního [Colchicum autumnale], který inhibuje buněčné dělení u mnoha vyšších organismů. Pokud působíme kolchicinem na buňky před dělením, zdá se zpočátku, že vše probíhá normálně. DNA chromosomů se zdvojuje, chromosomy se smršťují a řadí se v rovníkové rovině buňky a tím vytvoří dělící vřeténko. Nedojde však k rozdělení chromosomů a tvorbě dceřinných jader. Místo toho dělící aparát na nějakou dobu ustrne a potom zmizí, aniž splní svoji úlohu. Buněčné jádro se znovu utvoří, ale má dvojitý počet chromosomů. Krátkodobé působení kolchicinu se používá při pěstění v určitých růstových bodech, např. pokud chceme z diploidních rostlin (s dvojitou sadou chromosomů) připravit tetraploidní (se čtyřnásobnou sadou chromosomů). Biochemický průzkum ukázal, že se kolchicin váže na bílkovinné podjednotky dělícího aparátu a tím zabraňuje funkci dělícího vřeténka. Hlavní součástí vřeténka jsou mikrotubuly, rourkovité útvary vystavěné z molekul strukturální bílkoviny tubulinu. Vazba kolchicinu na tubulin se prokázala radioaktivním značením. Opačně lze prokázat přítomnost podjednotek tubulinu v bílkovinném extraktu, který váže kolchicin. Tak bylo objeveno, že nervové buňky, které se u dospělého organismu již nedělí, jsou obzvláště bohaté na tubulin. Je možné, že tubuly tvoří určitou vnitřní kostru v jemných nervových vláknech.

Ve všech případech, kdy se objasnil účinek jedovaté látky, šlo o vazbu na životně důležitou makromolekulu. Jako místa, kam se váží jedovaté látky, přicházejí v úvahu nukleové kyseliny (mitomycin, aktinomycin), enzymy (rifamycin, amanitin), ribosomy (streptomycin) a strukturální bílkoviny (kolchicin). Účinky jedů tak lze vysvětlit pomocí molekulární biologie, kdy vždy dochází k výměnným účinkům mezi makromolekulami. Vždy je třeba bezprostředního prostorového kontaktu.

Z fyzikálních vlivů, které ohrožují život buněk, se zmíníme pouze o ultrafialovém záření, které může dát podnět k zajímavým obranným mechanismům. Ultrafialové záření je silně pohlcováno nukleovými kyselinami. Energeticky bohatá kvanta UV záření mohou vyvolat v DNA osudnou změnu, kdy dvě thyminové báze, sousedící v témže prameni, se spojí dvěma vazbami a vznikne jediná molekula. Taková dvojitá molekula nemůže fungovat při Watson-Crickově párování bází a je proto životně důležité, aby se toto chybné místo v dědičné látce odstranilo.

Baktérie vyvinuly proto dva reparační systémy, které jim umožňují přežít malé dávky ultrafialového záření. První z nich spočívá na jediném enzymu, který dvojitou molekulu thyminu rozdělí na dvě molekuly. Podivuhodné je to, že tento enzym potřebuje ke svému účinku viditelné světlo. Druhý systém je nezávislý na světle, ale využívá tři různé enzymy. První z nich vyjme celý úsek pramene DNA, v němž se nachází dvojitá molekula thyminu. Vlastní oprava je založena na tom, že v DNA se informace daná sledem bází vyskytuje dvojnásobně. Mezera vzniklá v poškozeném prameni DNA se musí doplnit vytvořením komplementárním sledem bází vzhledem k nepoškozenému prameni. V tomto případě se uplatní syntetizující enzym, pravděpodobně polymerasa DNA, objevená Kornbergem. Třetí enzym má za úkol spojit nově vytvořený úsek s oběma konci původního poškozeného pramene DNA.

Mutace vznikající působením UV záření jsou způsobeny zřejmě tím, že reparační systém může udělat chybu a včlení do DNA chybné báze. Pokud křížením připravíme bakteriální kmeny, u nichž jsou oba reparační systémy vyřazeny, lze tyto kmeny usmrtit nepatrnými dávkami UV záření.

UV záření se svým účinkem podobá mitomycinu. Oba zásahy poškozují DNA tvorbou nežádoucích chemických vazeb a již v malých dávkách vyvolávají mutace. UV záření i mitomycin indukují v bakteriálních buňkách, které jsou lysogenní pro fágy lambda, namnožení fágů. Zřejmě se regulační systém fágů snaží zachránit dědičný materiál urychlenou produkcí potomstva dříve, než buňka zahyne.                                                                                           - pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci