Ve 20.letech 20.století prováděl anglický fyzik Astbury ozařování různých materiálů rentgenovými paprsky. Ozařoval vlasy, štětiny, kousky rohoviny a pozoroval ohyb paprsků prošlých tímto materiálem a zachycených na fotografické desce. V době Astburyho nikdo nemohl předpokládat výsledek těchto pokusů. Pokud by byl biologický materiál vnitřně neuspořádaný, amorfní, ohyb rentgenových paprsků nepřinesl žádné podstatné informace. Astbury studoval strukturální bílkovinu rohoviny keratin (řec. keras = rohovina). Při pozorování rohoviny pouhým okem nebo ve světelném mikroskopu nic nenapovídá nějaké struktuře. Přesto Astbury obdržel vzor ohybu překvapivé pravidelnosti. To ukazovalo, že keratin se skládá z vláken a že se stavební princip opakuje periodicky podél těchto vláken.

Keratin je svojí stavbou extrémní bílkovina. Je tvrdý a nerozpustný ve vodě. Jinou strukturální bílkovinou je kolagen, který lze zakoupit v čisté formě jako "želatinu". V suchém stavu tvoří rohovitou hmotu, v horké vodě se rozpouští a při zchladnutí nabobtnáním získává rosolovitou konzistenci. V této formě se kolagen vyskytuje v organismech živočichů, kde slouží jako opěrná a pojivová látka v podkoží, chrupavkách a kostech. Metodou ohybu rentgenových paprsků se brzy zjistilo, že také kolagen má pravidelnou strukturu, vláknitou molekulární stavbu.

Biologická úloha vláknitých bílkovinných molekul je poměrně jednoduchá a spočívá v elasticitě a mechanické pevnosti. Mnohočetná skupina "globulárních" bílkovin má buňkách významné úlohy, jako je transport určitých malých molekul nebo katalytické urychlení určitých biochemických reakcí. Své úlohy plní tyto bílkoviny volně rozpuštěné ve vodném prostředí. Ačkoliv jsou složeny z jednoho nebo více lineárních polypeptidických řetězců, jejich tvar je kulatý, globulární. Některé vědce zajímala otázka, jakým způsobem jsou řetězce v prostoru svinuty a zda jsou svinuty zcela určitým způsobem. Pro fyziky byl úkol velmi obtížný, protože globulární bílkoviny mění při odnětí vody svoji strukturu. Avšak již v roce 1840 se při studiu hemoglobinu došlo k poznatku, že za určitých podmínek může krystalizovat z koncentrovaných roztoků. Tmavě červené krystaly obsahovaly sice hojně vody a stabilní byly pouze ve vodném prostředí, ale princip jejich stavby byl stejný jako u krystalů anorganických solí. V té době ještě nikdo netušil, jak důležité závěry lze vyvodit z toho, že molekula bílkoviny je schopna krystalizovat.

Pokud má vzniknout krystal, musí jeho stavební složky mít stejný pravidelný tvar. Hemoglobin tedy nemůže být směsí různě stočených polypeptidických řetězců. V šesté kapitole jsme se dověděli, že se v první polovině 20.století podařilo připravit v krystalickém stavu značný počet enzymů. Proto enzymy také musí mít přesně definovaný molekulární tvar v rovině nebo v prostoru.

V Anglii tehdy vznikla tradice podložená Astburyho pracemi a vláknitými bílkovinami určovat strukturu biologických makromolekul fyzikálními metodami. Rakušan Perutz zde zahájil studium prostorové struktury hemoglobinu, zatímco jeho kolega Kendrew studoval stejnými metodami myoglobin. Bílkovina myoglobin rovněž váže kyslík, ale nenachází se v krvi, ale ve svalových buňkách. Je zejména hojně zastoupena ve svalech mořských savců, kteří při dlouhodobém potápění potřebují velkou zásobu kyslíku pro svalovou práci.

Myoglobin se svou stavbou podobá jednomu polypeptidickému řetězci hemoglobinu. Každá molekula obsahuje jednu molekulu červeného hemového barviva, na jehož centrální atom železa se váže atom kyslíku.

Brzy se ukázalo, že uspořádání atomů v molekule myoglobinu je do určité míry uspořádané, avšak nikoliv podle jednoduchého opakovacího vzoru, jako je tomu u vláknitých bílkovin.

Jednotlivé údaje byly shromažďovány mnoho let, kdy nastal souběh několika šťastných událostí. Perutz rozvinul novou techniku, kdy bílkovinné krystaly namáčel v roztoku soli těžkého kovu. Podle toho, jaká sůl byla použita, se atom kovu navázal na určité postranní řetězce aminokyselin, aniž se změnila prostorová struktura krystalu. Protože elektronové obaly atomů kovů způsobují silný ohyb rentgenových paprsků, vyvolá jejich umístění další významné efekty.

Chemici v oboru chemie proteinů v té době zjistili sledy aminokyselin v řetězcích hemoglobinu a myoglobinu. Jednak tím byla v řetězci určena poloha aminokyselin, které váží atomy těžkých kovů a jednak bylo možno doufat, že se aminokyseliny s charakteristickým tvarem molekul při rentgenové strukturální analýze znovu rozpoznají, jako např. aminokyselina fenylalanin s benzenovým jádrem. K tomu, aby se zakreslilo prostorové stočení polypeptidického řetězce tedy nebylo nutné určit polohu každého atomu.

Konečně se prokázalo, že prostorové stočení řetězce myoglobinu se velmi podobá stočení každého jednotlivého řetězce hemoglobinu. Výsledky Perutze a Kendrewa se tedy vzájemně potvrzovaly. Od roku 1959 se začala vyhodnocením dat měření objevovat trojrozměrná struktura obou molekul. Poměrně hrubý nárys prostorového stočení zprvu vědce zklamal, protože se z modelu nedalo vysledovat žádné jednoduché pravidlo nebo zákonitosti stavby. Model se podobal zauzlenému střevu.

Při detailní analýze prostorové stavby bílkovin se však začaly objevovat určité zákonitosti. Důležité předběžné studium k tomu poskytl americký chemik Linus Pauling. Při experimentování s molekulárními modely Pauling vytvořil model alfa-helixu, což byla šroubovice. Na tomto modelu však nejdříve nebyl vzat do úvahy vliv postranních řetězců. Pauling se spíše zajímal o to, jakým způsobem se základní kostra polypeptidického řetězce může v prostoru stočit tak, aby struktura byla stabilizována vytvořením slabších vedlejších vazeb. Zjistil, že tuto podmínku lze splnit tím, pokud obtočíme polypeptidický řetězec šroubovitě kolem myšleného povrchu válce tak, že na jednu otočku šroubovice připadne 3,6 aminokyselinových zbytků. Všechny karboxylové a aminové vazebné skupiny polypeptidických řetězců potom mohou vytvořit vzájemně vodíkové můstky a stabilizovat strukturu proti tepelnému pohybu. Různé postranní řetězce přitom směřují směrem ven od povrchu myšleného válce. Aminokyselina prolin, u které se do peptidické páteře zapojuje heterocyklický kruh s pěti atomy, se však nedala do modelu včlenit. Ukázalo se, že periodické rentgenové reflexy, které byly zjištěny při studiu keratinu, jsou skutečně vyvolány takovými alfa-šroubovicemi.

Perutz a Kendrew dále zjistili, že struktura alfa-helixu se vyskytuje také v globulárních bílkoviných. Určité části, které se v jejich hrubých modelech jevily jako poměrně rovné trubice, představovaly takové alfa-helixy (povrch takové šroubovice se zhruba jeví jako trubice). Na ně nasedají však vždy nepravidelně stočené části, kdy polypeptidický řetězec uhýbá v jiném směru, aby opět vytvořil část alfa-helixu. Tímto způsobem polypeptidický řetězec vyplňuje v prostoru určitý objem. Tito vědci dále zjistili, že rozmístění chemicky různých aminokyselin v tomto objemu není náhodné. Elektricky nabité (tedy kyselé a alkalické) postranní řetězce se totiž nacházejí převážně na povrchu molekuly, kdežto lipofilní aminokyseliny (lnoucí k tukům) jako valin, leucin a isoleucin, se vyskytovaly převážně uvnitř molekuly. Význam tohoto nálezu souvisí s funkcí bílkovinné molekuly. Kyselé a zásadité zbytky na povrchu mohou snadno reagovat s okolními molekulami vody a proto je molekula bílkoviny ve vodě rozpustná.

Souvislost s rozpustností nám ukazuje příklad hemoglobinu sprkovitých buněk. Ztráta hydrofilní (k vodě lnoucí) kyseliny glutamové a její nahrazení lipofilním valinem natolik sníží rozpustnost abnormálního hemoglobinu v krvi, že hemoglobin může vykrystalizovat a tím ohrozit život organismu.

Bílkovinné molekuly enzymů často obsahují prostorovou "prohlubeň", do které zapadá molekula substrátu a kde se katalyticky mění. Rentgenová strukturální analýza enzymu lysozymu z vaječného bílku přinesla názorný příklad. Lysozym je složen z 129 aminokyselinových zbytků. Protože je poměrně laciný, stabilní a dobře krystalizuje, používá se často pro studium struktury. Biologická funkce lysozymu spočívá v rozpouštění bakteriální buněčné stěny a tím k obraně proti infekci. U člověka se lysozym vyskytuje v slzách a nosním hlenu. Chemická struktura části buněčné stěny, která je napadána lysozymem, je molekulární směs polysacharidů a peptidů. Lysozym štěpí polysacharidy rozrušením zcela určité vazby mezi dvěma molekulami cukrů. Rentgenová strukturální analýza prokázala, že v molekule lysozymu je místo ve tvaru vajíčka, do kterého se přesně našikmo může umístit řetězec cukru. Vazba, která se má rozštěpit se pak dostane do blízkosti aminokyselinových zbytků kyseliny glutamové (č. 35) a kyseliny asparagové (č. 52). Reakční schopnost těchto kyselých skupin se prostorovým uspořádáním zvýší a dojde tak k rozštěpení vazby mezi molekulami cukru. Z těchto výsledků plyne závěr, že stočení bílkovinného řetězce souvisí bezprostředně s biologickou funkcí. Zůstává otázka, jak ke stočení dochází.

Transkripcí informační RNA vzniká polypeptidický řetězec. Avšak teprve prostorové stočení udělá z tohoto řetězce funkční bílkovinnou molekulu a dojde tak k projevu určitého znaku kódovaného genem. Je při procesu stáčení řetězce nutná další informace nebo toto stočení plyne automaticky ze sledu aminokyselin?

Aby vědci zodpověděli tuto otázku, šli nejprve opačným směrem a pokoušeli se rozrušit stočení bílkovinné molekuly. Takové rozrušení, při kterém se nenaruší chemické vazby mezi aminokyselinami, se označuje jako denaturace.

Pokud vlejeme vaječný bílek do horké vody, dojde k vysrážení globulárních bílkovin v něm obsažených. Tato denaturace je nevratná, ani po ochlazení se sražené bílkoviny ve vodě nerozpustí. Jiná situace je u tepelné denaturace strukturální bílkoviny kolagenu, kdy při vaření se želatina rozpouští ve vodě a po schlazení opět ztuhne.

Při tepelné denaturaci se rozruší uspořádané stočení polypeptidického řetězce a uvolní se vedlejší vazby, které toto stočení stabilizovaly. Tento proces lze přirovnat k tání krystalického pevného tělesa, ledu nebo parafinu.

Abychom vysvětlili chování globulárních bílkovin, musíme se vrátit zpět k výsledkům prostorové strukturální analýzy myoglobinu a hemoglobinu. Bylo zjištěno, že většina lipofilních postranních řetězců aminokyselin směřuje do nitra stočené molekuly, zatímco hydrofilní skupiny, které zodpovídají za rozpustnost, jsou koncentrovány na jejím povrchu a směřují vně. Pokud se tato uspořádaná struktura rozvine, dostanou se lipofilní postranní řetězce vně molekuly a vedou k neuspořádanému spojování mnoha bílkovinných molekul ve shluky nerozpustné ve vodě a bílkovina koaguluje.

Vláknitá bílkovina kolagen při zahřátí nekoaguluje, protože neobsahuje žádné shluky postranních řetězců lipofilních animokyselin. Jeho relativně jednoduchá prostorová struktura může sloužit jako vhodný model pro fyzikální pozorování. Jestliže kolagen zaujímá po tepelné denaturaci sám od sebe uspořádanou strukturu, musí tato struktura představovat stav s nízkou celkovou energií. Lze tedy konstatovat, že prostorová struktura kolagenu je důsledkem sledu aminokyselin a vhodných vnějších podmínek. Platí však totéž pro prostorovou stavbu globulárních bílkovin?

Americký chemik Anfinsen jako modelovou látku zvolil enzym ribonukleasu, jehož katalytická schopnost spočívá v štěpení řetězce RNA. Enzym lze získat ve velkém množství z pankreasu jatečního dobytka a ve srovnání s jinými globulárními bílkovinami je mimořádně stabilní. Skládá se z jediného polypeptidického řetězce o 124 aminokyselinách a prostorové stočení molekuly je stabilizováno čtyřmi disulfidickými můstky, na nichž se účastní osm cysteinových zbytků - viz příloha 10. Pokud jsou tyto můstky neporušené, lze enzym zahřát, aniž dojde k porušení jeho aktivity. Pokud provedeme chemickou redukci a disulfidické můstky převedeme na dvě oddělené thiolové skupiny SH, může se enzym účinkem tepla rozvinout. Stejného účinku se dosáhne kyselinou nebo koncentrovanou močovinou. Rozvinutím molekuly enzym ztratí svoji aktivitu. Pokud roztok zchladíme a dialýzou odstraníme denaturační činidla, řetězec se opět stočí. pokud necháme roztokem probublávat kyslík, cysteinové zbytky oxidují a vytvoří se znovu disulfidické můstky. Přitom najde každý cystein svého "správného" partnera, tedy disulfidické můstky se vytvoří tam, kde byly původně. Musely se tedy již předchozím stočením dostat vzájemně do správné polohy. Správné stočení enzymových molekul tedy vzniká zřejmě samovolně. Renaturační pokusy u dalších enzymů prokázaly, že stačí nalézt pouze příznivé podmínky a není třeba žádné dodatečné informace, protože ta je obsažena již v pořadí aminokyselin polypeptidického řetězce. S tímto poznatkem se nám jeví informace zakotvená v genech v novém světle: organismus nejenže může převádět lineární kód nukleových kyselin v lineární řetězce aminokyselin, ale tento kód obsahuje i návod k vytvoření prostorového tvaru bílkovinné molekuly.

Za prostorové stočení odpovídají různé chemické vlastnosti postranních řetězců aminokyselin. Některé zbytky aminokyselin podporují, aby polypeptidický řetězec zaujal v prostoru strukturu alfa-šroubovice. Jiné aminokyseliny, jako např. prolin, vedou k přerušení šroubovice. Lipofilní zbytky aminokyselin jsou obráceny dovnitř molekuly, hydrofilní zbytky jsou orientovány vně. Různé zbytky aminokyselin se vzájemně váží vodíkovými můstky. Ačkoliv známe dnes celou řadu těchto skutečností, nejsme dosud schopni předpovědět prostorové stočení ani v případě, že známe sled aminokyselin v polypeptidu. Problém se řešil na počítači, kdy byl vytvořen program a jako data byly zadány všechny chemické údaje o postranních řetězcích aminokyselin a jednoduchých sledech aminokyselin. Program měl zvážit nejvýhodnější možnosti stočení z hlediska celkové energie. Neúspěch byl zaviněn především tím, že chemické údaje o aminokyselinách nejsou zcela přesné a i při velmi malém množství aminokyselinových zbytků je počet možných prostorových uspořádání velmi vysoký. Přesto pokusy v tomto směru pokračují a vytvářejí se matematické prostorové modely molekul.

Místo výpočtů prostorové struktury molekul se začaly srovnávat důsledky záměn aminokyselin v řetězcích peptidů. Tyto záměny aminokyselin vznikají v důsledku mutací. Studium obalové bílkoviny viru tabákové mozaiky ukázalo úlohu určitých zbytků aminokyselin, které se uplatní při stabilitě stočeného řetězce. Obalová bílkovina divokého typu TMV je polypeptidický řetězec se 158 členy a obsahuje zbytky prolinu v poloze 20, 63 a 156. Ve virologických laboratořích v Berkeley (Kalifornie) a v Tubingen byly izolovány mutanty, v jejichž obalové bílkovině byly prolinové zbytky změněny na zbytky jiných aminokyselin. V některých případech byly záporně nabité aminokyseliny zaměněny za neutrální. Ukázalo se, že některé z těchto mutant nemohly při vyšší teplotě (35 stupňů Celsia) tvořit v rostlinách virové částice a příčinou byla snížená tepelná odolnost obalové bílkoviny. Na tomto modelu bylo možno sledovat vliv nepatrných záměn ve sledu aminokyselin na stabilitu stočení.

Je zřejmé, že stejná záměna na různých místech řetězce má zcela různé důsledky. V polohách 19 a 20 je zřejmě kritické místo, kde každá porucha záměnou aminokyseliny snižuje stabilitu bílkoviny. Z těchto i jiných výsledků vyplynulo, že každý zbytek aminokyseliny, podle své polohy, přispívá určitým způsobem ke stabilitě a prostorovému uspořádání stočeného řetězce.

Trojrozměrné stočení se nenachází jen u bílkovin, ale také u transferových ribonukleových kyselin. Podobně jako bílkovinné molekuly, lze také molekuly transferové RNA rozvinout při zahřátí. Mimo to jsou známy mutace, u nichž jednotlivé záměny bází snižují odolnost stočeného řetězce vůči teplotě.

Popsali jsme krátce biologickou úlohu tRNA jako přenašeče aminokyselin do bílkovinného řetězce podle informace uložené v RNA. Molekuly tRNA se skládají z jednopramenných řetězců a mají 70 až 80 bází. Transferová RNA z kvasnic pro přenos alaninu (alanyl-tRNA), viz příloha 5, byla první molekulou nukleové kyseliny, u níž byl chemickou analýzou zjištěn úplný sled bází. Analýzu provedl Američan Holley v roce 1965. Od té doby byl stanoven sled aminokyselin u většiny tRNA, obvykle u kvasnic nebo E.coli, takže bylo možno odhalit obecná pravidla jejich struktury. Podle současných znalostí tvoří takový řetězec tři spirálové smyčky, takže celkovou strukturu lze dvojrozměrně znázornit jako "jetelový lístek". Spirálové stočení pramene tRNA bylo možno správně předpovědět již ze známého sledu bází. Nově se podařilo připravit tRNA v krystalickém stavu a provést rentgenovou strukturální analýzu. První výsledek byl oznámen v roce 1973 a týkal se tRNA z kvasnic pro přenos fenylalaninu. Zjistilo se, že "jetelový lístek" je ještě stočen tak, že tvoří tvar písmene L. Na jednom konci řetězce RNA, který se nachází na kratším rameni písmene L, se napojuje aminokyselina. Delší rameno písmene L je tvořeno řadou smyček. Na rozdíl od bílkovin měla teoretická předpověď prostorové struktury ze známého sledu bází tRNA značný úspěch, ikdyž pouze částečný. Důvodem bylo, že důsledky záměn bází nukleových kyselin jsou lépe známy než důsledky záměn aminokyselin. Při zpětném stáčení jednopramenné ribonukleové kyseliny totiž platí Watson-Crickova pravidla o párování bází s výjimkou toho, že adenin se páruje s uracilem místo s thyminem. Kromě toho se na určitém místě pramen RNA "vlásenkovitě" ohýbá nazpět. Tam, kde spirála otáčí směr, tedy na vrcholu spirály, je jakési "očko", kde je jednopramenná část molekuly obzvláště exponována v prostoru. Taková místa mohou sloužit pro rozpoznávání.

Jaký je tedy biologický význam zpětného stáčení molekul tRNA? Transferová RNA se někdy označuje jako nukleová kyselina, která se snaží napodobit bílkovinu. Molekuly tRNA zaujímají při překladu genetického kódu prostředníka mezi nukleovou kyselinou a bílkovinou. Proto tRNA musí mít schopnost se vázat jak k nukleové kyselině tak k bílkovině. Nejdříve se vhodným aktivačním enzymem napojí na jeden konec tRNA příslušná aminokyselina. Představujeme si, že příslušné tRNA (pro 20 aminokyselin) jsou prostorově stočeny tak, aby mohly "zapadat" přesně do "prohlubní" aktivačních enzymů. Transferová RNA nesoucí aminokyselinu se musí napojit na ribosom a tam rozpoznat příslušný triplet bází v informační RNA, který určuje kódové slovo aminokyseliny. Pokud kódové slovo odpovídá dané aminokyselině, přenese tRNA svoji aminokyselinu na rostoucí polypeptidický řetězec. Rozpoznání kódového slova je zajištěno na střední smyčce "jetelového lístku", kde se nachází antikodon, který je komplementární ke kódovému slovu informační RNA. Po uvolnění aminokyseliny se transferová RNA může zúčastnit dalšího přenosu. Tyto procesy jsou příkladem, jak se v organismu dosahuje přesnosti pochodů vzájemnou interakcí prostorově si odpovídajících molekul.

Důmyslné prostorové stočení biologických makromolekul je dáno výhradně sledem stavebních složek. Jakmile je tento sled jednou dán, automaticky se při vhodných vnějších podmínkách zaujme prostorové uspořádání. Tento stav musí tedy z hlediska volné energie představovat stav s nejnižší energií. Ovšem podle druhé věty termodynamiky entropie roste, stav uspořádaný se mění na stav neuspořádaný. Budeme se snažit tento rozpor alespoň v hrubých rysech vysvětlit.

S klesající teplotou klesá i tendence rušit pořádek, jak lze vidět v soustavě pára-voda-led. Proto při stoupání teploty přechází uspořádané stočení molekul nukleových kyselin a bílkovin v denaturované molekuly. Je-li tedy teplota příliš vysoká, nepředstavuje nativní stav již stav s nejnižší energií. Dále nelze makromolekuly uvažovat izolovaně, ale je třeba je uvažovat také s molekulami vody, které je obklopují. Fyzikální chemici tvrdí, že při fyziologické teplotě může rozvinutá bílkovinná molekula vnutit okolním molekulám vody vysoký stupeň pořádku, neboť hydrofobní aminokyselinové zbytky směřují vně molekuly (molekuly vody mohou zaujímat méně stavů, neboť hydrofobní zbytky některé stavy nepovolují). Pokud jsou tyto zbytky uspořádány uvnitř molekuly, interagují okolní molekuly vody pouze s hydrofilními zbytky aminokyselin a podléhají tak snáze tepelnému pohybu. Celkem se tím udělí systému vyšší stupeň neuspořádanosti a tím i nižší obsah volné energie než v případě rozvinuté molekuly. Stejné úvahy vysvětlují i překvapivou schopnost některých bílkovinných molekul shlukovat se a tvořit vysoce uspořádané ultrastruktury - stavební prvky buňky.

První podnět k vysvětlení prostorové stavby v mikroskopické oblasti přišel z virologie. V 40.letech 20.století udělal Schramm se spolupracovníky v Tubingen objev, který vypadal velice skromně. Když při pokusech byl přidán k suspenzi viru tabákové mozaiky alkalický roztok, zmizel opalescentní zákal, který je vytvářen rozptylem světla na virových částicích. Když byla přidána kyselina octová, která neutralizovala alkalický roztok, opalescence se znovu objevila. Protože opalescence (rozptyl) světla je mírou velikosti částic, došli vědci k závěru, že TMV se v alkalickém prostředí rozpadá na menší částice, které se po neutralizaci spojují. Tento závěr byl potvrzen pozorováním na analytické ultracentrifúze. Virové částice, na které nebylo působeno, měly při sedimentaci hodnotu 200 Svedbergových jednotek, po přidání kyseliny jen 3 až 30 S, a po následující neutralizaci opět 100 - 200 S. O vlastním tvaru částic však rozptyl světla a rychlost sedimentace příliš neřekl. Podle toho, co již víme o koagulaci denaturovaných bílkovin, lze tyto nálezy vysvětlit tak, že umělé agregáty vznikly z denaturovaných molekul obalové bílkoviny. Rozhodující odpověď přineslo teprve vyšetření vzorků pod elektronovým mikroskopem. S použitím tehdejší poměrně primitivní techniky se virové částice jevily jako tyčinky o délce asi 3000 angstromů a průměru asi 150 angstromů (1 angstrom = 10^-8 cm). Po přidání alkálie bylo možno vidět jen malá zrníčka, po přidání kyseliny pro neutralizaci vznikly opět tyčinky stejného průměru jako měly původní částice, ale různé délky. Oddělené stavební složky se tedy opět spojily uspořádaným způsobem a tento proces byl vyvolán pouze volbou fyzikálně chemického prostředí.

K tomu, aby byla výstavba tvarů a konečná prostorová struktura virových částic přesně prozkoumána, bylo zapotřebí citlivějších metod. Negativním barvením v elektronovém mikroskopu a ohybem rentgenových paprsků bylo zjištěno, jak jsou podjednotky obalové bílkoviny a vlákno RNA uspořádány. Podle těchto nálezů má virová částice TMV tvar dutého válce, jehož silná stěna se skládá ze spirálovitě uspořádaných bílkovinných podjednotek, mezi nimiž prostupuje vlákno RNA. Vlákno RNA určuje délku virové částice a tím i počet stavebních podjednotek, kterých je asi 2100. Určitý počet podjednotek (16 a 1/3) obalové bílkoviny tvoří jeden závit spirály. Podjednotky v sousedních závitech šroubovice jsou tedy posunuty vždy o 1/3 své šířky. Stoupání spirály odpovídá výšce jedné podjednotky. Celá spirála tvoří uzavřenou stěnu válce.

Američané Fraenkel-Conrat a Williams významně upřesnili Schrammovy pokusy. Nepoužili rozbité částice TMV, ale odděleně izolovali obalovou bílkovinu a intaktní RNA. Obě tyto chemicky definované látky rozpustili v neutrálním roztoku soli a smísili v poměru, v jakém se vyskytují ve virové částici (5% RNA, 95% bílkoviny). Vytvořily se virové částice, které nejen měly správnou délku a tloušťku, ale byly i vysoce infekční. Spontánní sestavení úplné virové částice TMV ve zkumavce dokazuje, že není zapotřebí cytoplasmy živé buňky. Jak je však možné, že tisíce bílkovin a stovky nukleových kyselin obsažených v cytoplasmě neruší tento proces? Důvodem je zřejmě to, že obalová bílkovina TMV a ribonukleová kyselina se vzájemně rozpoznají.

Je výstavba tvarů určována pouze ribonukleovou kyselinou nebo pouze bílkovinou nebo oběma makromolekulami? Již víme, že RNA jednoznačně určuje pořadí aminokyselin v bílkovině a tím i její konečné vlastnosti. Brzy se zjistilo, že lze získat dutý válec se spirálovou strukturou stěny, ikdyž různé délky, také okyselením roztoku čisté obalové bílkoviny. Podjednotky obalové bílkoviny (jejichž molekulová hmotnost 17000 odpovídá přibližně hmotnosti myoglobinu) se při tom nejdříve seskupují v trojskupiny, potom v kruhy a dvojité kruhy. Obvod kruhové struktury obsahuje 17 podjednotek. Větší počet dvojitých kruhů se konečně spojuje ve válec, takže diskontinuální struktura oddělených kruhů přechází v jednotnou zploštělou spirálu.

Spojování molekul obalové bílkoviny se velmi podobá krystalizaci. Symetrie spirály vzniklého krystalu klade jen nepatrné nároky na symetrii stavebních složek. Jakékoli množství asymetrických útvarů, které mají na povrchu určitým způsobem seskupeny záchytné body, může teoreticky přejít ve spirálovou ultrastrukturu. Obranná funkce obalové bílkoviny vyžaduje, aby výška závitu odpovídala právě výšce stavební podjednotky a vznikl tak uzavřený válec. U některých mutant TMV vede záměna aminokyselin k porušení tvaru podjednotky. Tyto obalové bílkoviny mutant se spojí v otevřený válec, který nechrání citlivou RNA proti rozšířeným ribonukleasám.

Z těchto údajů plyne, že především obalová bílkovina odpovídá za tvar virové částice. Uvnitř uložená řetězová molekula RNA však určuje délku dutého válce a stabilizuje spirálovou strukturu proti změnám vnějších podmínek. Této stabilizace je zřejmě dosaženo vazbou mezi záporně nabitými zbytky kyseliny fosforečné v RNA a určitými kladně nabitými zbytky aminokyselin obalové bílkoviny. Naproti tomu se při spojování podjednotek uplatní stejné síly, které zajišťují soudržnost uvnitř bílkovinné molekuly. Hydrofobní zbytky aminokyselin mají tendenci mezi sebou interagovat a tím uvolňovat obklopující plášť molekul vody.

Když byl objasněn tvar virové částice TMV, byly objevovány v celé mikroskopické oblasti spirálové struktury, které vznikají spojováním podjednotek globulárních bílkovin. Například bičíky baktérií jsou složeny ze tří spirálovitě vzájemně obtočených řetězců z globulárních bílkovin. Stejně jako u TMV se podařilo izolovat podjednotky, které za určitých podmínek znovu agregovaly v bičíky.

Novotvorba bičíků byla ve zkumavce výrazně urychlena, pokud se k uvolněným podjednotkám přidalo malé množství zlomkových částí bičíků. Tyto části, u kterých jsou podjednotky již ve správném prostorovém uspořádání, účinkují zřejmě jako krystalizační jádra, na která se napojují další podjednotky. Chemikům je známo, že krystalizaci nasyceného roztoku nějaké látky lze vyvolat přidáním nepatrného množství krystalizačních jader téže látek.

Velmi obdobně jako bičíky baktérií je vystavěna součást kontraktilních svalových vláken živočichů, aktin. Také u této makromolekuly se podjednotky globulární bílkoviny spojují ve vláknité agregáty. Kontraktilní vlastnosti se však projevují teprve při souhře se silnějšími vlákny myosinu, která jsou vystavěna mnohem složitěji. Myosin a aktin se spontánně spojují v komplex, který je schopen kontrakce.

Vnějším tvarem jsou viru TMV podobné rourkovité bílkovinné agregáty, které se označují jako mikrotubuly. Tyto struktury lze pozorovat v elektronovém mikroskopu při studiu živočišných a rostlinných buněk. Vřeténkový aparát, s jehož pomocí se chromosomy při buněčném dělení rozestupují uspořádaným způsobem, se skládá převážně z paralelně položených svazků těchto mikrotubul. Mikrotubuly se hojně vyskytují během vývoje mozkové tkáně u ptáků a savců. Mozkové buňky interagují vzájemně pomocí extrémně dlouhých tenkých výběžků a v těchto výběžcích nacházíme svazky mikrotubul. Zdá se, že tvoří jakousi vnitřní páteř zpevňující jemná pokračování nervů a pomáhají jim udržet jejich směr. Nedávno se zdařil pokus napodobit ve zkumavce tvorbu mikrotubul z vyčištěných bílkovinných podjednotek.

Po spirálách jsou to pravidelné polyedry (mnohostěny), které mají nejjednodušší symetrické poměry. Takové polyedry skutečně nacházíme v subcelulární oblasti, přičemž nejčastěji se vyskytuje ikosaedr (pravidelný dvacetistěn). Viry jsou opět klasickými příklady. Mnohé rostlinné viry, poliovirus a malé RNA-fágy mají symetrii polyedru. Nejjednodušším příkladem jsou rostlinné viry, jejichž bílkovinný obal se podobně jako u částic TMV skládá z jediného druhu bílkoviny.

Mezi molekulárními biology se vyskytli vědci, kteří se zabývali krystalografií. Vyzkoumali pravidla, podle kterých se podjednotky bílkovin musí spojit, aby vznikl obal ve tvaru pravidelného polyedru. Podle jejich teoretických předpovědí může mít počet stavebních kamenů jenom určitou hodnotu, např. 60, 120 nebo 180, má-li struktura vzniknout spontánní výstavbou. V době, kdy byla vyslovena, se však tato teorie ještě neprokázala. Teprve dvacet let po Schrammově pokusu s virem TMV se podařilo z jednotlivých součástí sestavit ve zkumavce polyedrické rostlinné viry. Ukázal se velmi zajímavý rozdíl ve srovnání se spontánní výstavbou částic TMV. V některých případech je zapotřebí RNA (nebo jiné řetězové molekuly s kyselými skupinami), aby se bílkovinné jednotky přiměly k vytvoření uzavřeného obalu. Jakmile se však obal jednou pevně sestaví, může být RNA za šetrných podmínek znovu uvolněna, aniž se obal zhroutí. Zbylá prázdná částice již ovšem není infekční.

Tam, kde se setkáme s jednoduchou symetrií, symetrií spirály nebo pravidelného polyedru, vznik těchto struktur připomíná určitý druh krystalizace. Avšak jak vznikají subcelulární útvary, jejichž tvar je poměrně nepravidelný a nemá žádnou jednoduchou symetrii? Podívejme se na ribosomy. Ribosomy jsou složeny ze dvou nestejně velkých částí, podjednotky 30S a podjednotky 50S (zde slovo "podjednotka" neznačí jedinou bílkovinnou molekulu, ale rozsáhlý komplex molekul). Hodnoty S (Svedbergova jednotka) udávají, jak rychle tyto podjednotky sedimentují v centrifúze. Každá podjednotka 50S obsahuje jednu molekulu RNA o délce asi 3000 bází, jednu molekulu RNA o délce asi 100 bází a asi 30 různých bílkovin. Podjednotka 30S obsahuje molekulu RNA o délce asi 1500 bází a asi 20 různých bílkovin. Celý ribosom je vystavěn o mnoho složitěji než malé polyedrické viry, které se rovněž skládají s RNA a bílkoviny a jsou přibližně stejně velké jako ribosom. Podle funkce komplex ribosomu představuje složité zařízení pro čtení genetického kódu a sestavování bílkovin.

Podjednotky ribosomu byly rozloženy na ribonukleové kyseliny a různé bílkoviny. Tyto složky byly za vhodných podmínek smíchány a opět se získaly kompletní podjednotky. Obě podjednotky se spontánně spojily v přítomnosti iontů hořčíků a v bezbuněčném stavu byly schopny syntetizovat bílkoviny. Vědci dosud neznají prostorové uspořádání příslušných 50 bílkovin, protože tento problém leží mimo hranice možností elektronového mikroskopu. Prokázalo se však, že sestavení ribosomu může proběhnout bez přítomnosti buněčných struktur, enzymů a energeticky bohatých trifosfátů.

Nesmíme si však představovat, že se všech dvacet bílkovin současně napojí na RNA a vytvoří podjednotku ribosomu 30S. Tento proces by byl již ze statistického hlediska velmi málo pravděpodobný. Nejprve se na RNA napojí tři bílkoviny. Teprve potom mají tendenci se připojit další bílkoviny, zřejmě proto, že RNA se napojením tří bílkovin prostorově stočí a vytvoří záchytná místa pro další bílkoviny. Některé další bílkoviny se nenapojují na RNA, ale na bílkoviny, které se napojily dříve. Pokud v reakční směsi chybí jedna z časně se napojujících bílkovin, k sestavení podjednotky vůbec nedojde. Pokud ovšem chybí jedna z bílkovin, které se napojují nakonec, vzniknou podjednotky, které jsou téměř tak velké jako 30S, ale nejsou biologicky aktivní. Čím dříve se bílkovina zapojuje do stavby, tím důležitější má význam pro celkovou strukturu podjednotky. Časový sled spontánního spojování zrcadlí celkovou logiku stavebního plánu.

Organismus stojí někdy před problémem, že určitá struktura má vzniknout pouze za určitých podmínek. Nejjednodušší případ spontánní výstavby, který jsme viděli u viru tabákové mozaiky, nepočítá s takovou možností a za fyziologických podmínek nelze zabránit vzniku struktury. Jedním z případů "podmíněné spontánní výstavby", který je v medicíně podrobně prostudován, je srážení krve. Stroma (podpůrná vazivová tkáň) krevní sraženiny, do které se uzavřou červené krvinky a jiné součásti krve, je z molekulárního hlediska vysoce uspořádaná síťovitá struktura, která vznikne nahromaděním vláknité bílkoviny fibrinu. Aby se rána rychle uzavřela, musí být fibrin, jako strukturální podjednotka, rozpuštěn v krevní plasmě ve vysoké koncentraci. Současně musí být zajištěno, že fibrin nebude agregovat v krevních cévách. K emboliím a infarktům dochází právě tím, že krevní sraženina, trombus, se dostane do krevního oběhu. Tento problém obchází organismus tím, že v krevní plasmě není rozpuštěn fibrin, ale jeho prekursor fibrinogen. Makromolekula fibrinogenu má tvar tyčinky. Skládá se z více polypeptidických řetězců, které jsou vzájemně spojeny disulfidickými můstky. Sám od sebe netvoří síťovitou strukturu. Při poranění se rozrušením buněk vyvolá celý řetěz biochemických signálů, které posléze vedou k aktivaci proteolytického enzymu trombinu. Trombin odštěpí z fibrinogenu dva zcela určité úseky jednoho polypeptidického řetězce, což způsobí, že jedna koule z činky vypadne. Trombin změní tedy sled aminokyselin ve fibrinogenu tím, že odpadnou části řetězce. Nový sled aminokyselin, řetězce fibrinu, vedou k novému stočení molekuly. Při vypadnutí jedné činkové koule se uvolní nové záchytné body a molekuly fibrinu v několika sekundách agregují v uspořádanou strukturu síťovitou strukturu, která zabrzdí tok krve. Tuto strukturu lze ve zkumavce rozložit a opět složit. Nelze však z fibrinu vytvořit znovu fibrinogen.

Velmi pěkným příkladem submikroskopické výstavby tvaru je stavba komplexní struktury fágů T4, studovaná podrobně pracovní skupinou Kalifornského technologického institutu. Ve srovnání s RNA-fágy je fág T4 poměrně velký a složitě vystavěný útvar. Jeho smyslem je kromě přenosu genetického materiálu přenos tohoto materiálu do buňky hostitele. Částice se skládá z "hlavičky" a "bičíku". Na konci bičíku je destička a šest bičíkových vláken. Hlavička se skládá z bílkovinné membrány, vnitřek je vyplněn DNA, která je tam velmi hustě vměstnána, spolu s některými bázickými bílkovinami. Tvar hlavičky je šestiboký hranol zakončený dvěma šestibokými jehlany. Bičík se skládá z obalu tvořeného spirálovitě stočenými bílkovinnými podjednotkami dále z vnitřní trubičky a koncové destičky, na které jsou nasazena tenká, blíže středu ohnutá vlákna, připomínající nohy pavouka.

Když fág T4 náhodně narazí na buněčnou stěnu baktérie E.coli, bičíková vlákna se tam uchytí a zakotví fág kolmo k buněčnému povrchu. Bičík je zakončen strukturou obsahující enzym, který rozpustí stěnu bakteriální buňky. Potom dojde ke smrštění vnějšího obalu bičíku a DNA může vnitřní trubičkou vstoupit do bakteriální buňky. Fág T4 je určen asi 40 různými geny. Pokud by fágová částice T4 měla vzniknout spontánní výstavbou, museli bychom ve fágové částici nalézt asi 40 různých bílkovin. Technicky je ovšem obtížné rozhodnout, které bílkoviny jsou přítomny jenom ve velmi malých množstvích a které nejsou v hotové částici přítomny vůbec. Různé mutanty poskytly více informací o konstrukci částice T4 než přímá chemická analýza.

Lze si dobře představit, že jednotlivé části fágů T4, jako bílkovinná membrána hlavičky, trubice bičíku a vlákna bičíku, vznikají samovolnou výstavbou. Jak jsou však jednotlivé částice sestaveny v hotový fág? Tuto otázku bylo možno zodpovědět pomocí podmíněně letálních mutant.

Jsou to buď mutanty, u kterých došlo k přerušení řetězce a které mohou u určitých bakteriálních kmenů tvořit pouze zlomek polypeptidu příslušné bílkoviny, nebo to jsou termosenzitivní mutanty, u nichž denaturuje příslušná bílkovina již při mírně zvýšené teplotě. Podstatné je to, že experimentátor si může vlastní volbou podmínek připravit funkčně schopné viry, ať již jako zásobní kulturu nebo defektní viry pro pokusné účely. Podle toho, který gen účastnící se strukturální výstavby fágu je defektní, obdržíme v infikovaných buňkách různé části fágů, jako např. pouze hlavičky nebo pouze bičíky anebo nespojené hlavičky a bičíky anebo hlavičky s bičíky, u kterých chybí vlákna. Ve zkumavce byl smíšen buněčný extrakt, který obsahoval pouze hlavičky, s extraktem obsahujícím pouze bičíky a skutečně byly získány fágy, které byly opět schopné vyvolat infekci. V těchto případech je sestavení zřejmě spontánní. Bylo možné též hlavičky a bičíky odděleně vyčistit a v nepřítomnosti jiných látek je přimět k tomu, aby se samovolně spojily.

Jsou však i případy jiných mutant, kdy v buňkách nalezneme hlavičky i bičíky, které se však nemohou spojit. Tato skutečnost ukazuje, že před sestavením musí být jedna z částí nějakým způsobem upravena. Zjistilo se, že to jsou hlavičky, které musí být upraveny buď napojením nepatrného adaptoru nebo účinkem enzymu. Druhý případ, s kterým jsme se již seznámili při srážení krve, se uplatňuje také při napojení vláken bičíku na destičku u částice, která je jinak již kompletní. Mutantám, u kterých se tyto stavební části nespojily, můžeme v reakční zkumavce "pomoci" tím, že přidáme malé množství buněčného extraktu, který obsahuje příslušnou bílkovinu. Buněčný extrakt musí být získán z buněk infikovaných fágy T4, které mohou uskutečnit toto spojení. Zahřátím ztratil extrakt svůj aktivační účinek. Zjistilo se, že účinnou součástí je proteolytický enzym, který uvolní záchytné místo. Tento enzym je syntetizován na základě informace jednoho fágového genu.

Zapojení takových enzymů, které mohou v případě potřeby vyvolat určité stupně spontánní výstavby, dává organismům možnost regulovat výstavbu složitých struktur. To nic nemění na základním významu krystalizačního procesu jako principu subcelulární tvorby tvarů. V další kapitole se dovíme, že také aktivita enzymů je v některých případech blokována nebo uvolněna teprve odštěpením úseku polypeptidického řetězce. Jde ovšem jenom o jednu z mnoha možností, jak přizpůsobit enzymovou aktivitu vzniklé potřebě.

Vraťme se však k otázce, jakým řetězem pochodů se realizuje genetická informace. Nyní máme již k dispozici dosti ucelené schéma. [E1]

Do tohoto schématu zapadají také RNA-viry, neboť jejich informační RNA může působit teprve tehdy, když genové produkty hostitelské DNA jsou k dispozici, tj. ribosomy, transferová RNA, aktivační enzymy aminokyselin atd. Schéma je na několika místech uzavřené. Aby mohly být podle instrukcí genů vybudovány enzymy a strukturální bílkoviny, musí být již takové enzymy a bílkoviny přítomny. To je patrně důvod, proč za dnešních podmínek na planetě Zemi život probíhá jen v buňkách a proč nový život vzniká jen z života již existujícího. Dvojité čáry znázorňují procesy, které vyžadují dodání energie. Jednoduché čáry znázorňují procesy, které nepotřebují dodání energie. Enzymy zasahují do těchto procesů modifikujícím a regulačním způsobem, když odštěpují části řetězců molekul a tím uvolňují záchytná místa nebo enzymaticky aktivní centra.

                                                                                             - pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci