V roce 1944, kdy Avery a jeho spolupracovníci v New Yorku prokázali význam DNA jakožto dědičné látky, vyšla v Irsku kniha rakouského fyzika Erwina Schrodingera "Co je život?". Schrodinger nevěděl o Averyho pokusech a slovo DNA se v jeho knize nevyskytovalo. Vycházel z výsledků klasické genetiky a z některých poznatků vlivu záření na biologické pochody. Kladl si otázku, čím musí být vybavena dědičná látka, aby bylo možno porozumět jejím základním vlastnostem, jako je stálost, příležitostná proměnlivost prováděná skokem a obsah informace.

Jako příklad stálosti charakteristického dědičného znaku uvedl Schrodinger převislý dolní ret, který byl po mnoha generací znakem rodu Habsburků. Ať již byla příslušná dědičná látka jakákoliv, musela v průběhu století při teplotě 37 stupňů uchovat tento dědičný rozdíl oproti dědičné látce jiných rodin. Kromě toho musel tento rozdíl kdysi vzniknout. Dědičný materiál, přestože je pozoruhodně stálý, podléhá mutacím, příležitostným náhlým změnám. Mutace jsou za normálních okolností vzácné, ale určité zevní vlivy, jako je rentgenové záření, mohou nesmírně zvýšit jejich frekvenci výskytu. Překvapující vlastností dědičné látky je to, že dokáže uchovat nesmírně mnoho informací na malém prostoru.

Schrodinger rozlišuje mezi neuspořádaným stavem hmoty, který je u plynů a kapalin, a stavem uspořádaným, což jsou molekulární struktury a krystaly. V neuspořádaných strukturách atomy na sebe narážejí v důsledku tepelného pohybu. V krystalu nebo uspořádaných molekulárních vazbách jsou sice atomy v pohybu, ale udržují si své místo vzhledem k sousedním atomům, pokud tyto pohyby nepřekročí určitou mez. Schrodinger uzavírá, že pouze uspořádaná struktura může mít úžasnou stálost, která je charakteristická pro dědičnou látku. Někdy může dojít k náhodné koncentraci energie, což vede k malé ale trvalé změně krystalové struktury. To odpovídá mutaci. Typický krystal je trojrozměrný vzor, který se neustále opakuje. Proto krystal obsahuje jen velice málo informace, protože jeho stavba je periodická. Schrodinger proto uvažoval, že dědičná látka je "aperiodickým krystalem".

Usuzoval Erwin Schrodinger správně? Hodí se jeho teoretické požadavky na DNA, o jejíž souvislosti s dědičností nic nevěděl? Až do Averyho objevu věnovalo pouze málo badatelů čas na chemickou analýzu DNA, protože biologická funkce této látky byla nejasná. Bylo známo, že jde o obrovskou řetězcovou molekulu jejíž členy byly složeny vždy z dusíkaté báze (nukleotidu), desoxyribosy a fosfátového zbytku (viz příloha 5). Jednotlivé členy lze získat při štěpení molekuly DNA kyselinou. Štěpné produkty pak lze oddělit elektroforézou nebo chromatografií např. na filtračním papíře, kdy po osvětlení ultrafialovým zářením lze rozeznat čtyři skvrny. Další chemická analýza prokázala, že tyto štěpné produkty se lišily v dusíkatých bázích (nukleotidech):

adenin-desoxyribosa-fosfát                     nukleotid A

guanin-desoxyribosa-fosfát                     nukleotid G

thymin-desoxyribosa-fosfát                     nukleotid T

cytosin-desoxyribosa-fosfát                     nukleotid C

Bázi adenin již známe z molekuly ATP (viz příloha 7). Guanin byl poprvé izolován z ptačích exkrementů (guána), thymin byl poprvé izolován v brzlíku (thymus) u telat a cytosin byl nalezen v buňkách (řecky kytos = buňka).

Podle prvních ještě dosti nepřesných chemických analýz DNA se zdálo, že všechny čtyři báze se vyskytují se stejnou frekvencí. Někteří vědci tehdy uvažovali, že DNA má periodický sled bází. Tím by ovšem DNA měla pouze podružný význam, podobně jako polysacharid celulosa, který zpevňuje buněčné stěny rostlin. Rakousko americký biochemik Chargaff zvýšil citlivost analytických metod a brzy prokázal, že báze se nevyskytují v DNA ve stejném množství a že procentní poměry kolísají podle druhu organismu.

Z naměřených zaokrouhlených hodnot Chargaff vyvodil pravidlo, kdy zjistil, že obsah báze G je roven obsahu báze C, obsah báze A je roven obsahu báze T, tedy že součet obsahů bází G a A je roven součtu obsahů bází C a T.

Na příčinu pravidla nemohli dát biochemici uspokojivou odpověď. Zjistili však, že stavební složky jsou v DNA vzájemně propojeny. Páteř DNA tvoří desoxyribosa a fosfátové zbytky, na molekuly desoxyribosy jsou navěšeny jednotlivé báze.

Mezitím někteří fyzikové hovořili o tom, že DNA bude patrně zajímavým objektem pro strukturální výzkum metodou ohybu rentgenových paprsků. Vědci Maurice Wilkins a Rosalind Franklinová z Londýna si opatřili DNA, kterou chemici extrahovali z telecího thymu. Jednoduchým "natažením vláken" se viskosní DNA uspořádala tak, že molekulární řetězce ležely paralelně. Takový vzorek byl vsunut do skleněné kapiláry a ozařován. Paprsky, které prošly vzorkem byly zachyceny na fotografické desky. Vědci zjistili, že jejich materiál musí mít vysoce uspořádanou strukturu. Vyplynulo to z charakteristického vzoru zčernalých skvrn na fotografické desce. Nejnápadnější skvrny ohybového vzoru tvořily písmeno X. Teorie ohybu však předpovídala, že takový vzor je vyvolán šroubovitou strukturou. Wilkinson a Franklinová museli ještě vyloučit, že tato pravidelnost není artefaktem, který by vznikal při extrakci a čištění DNA z telecího thymu. Prozkoumali proto biologické materiály s velkým obsahem DNA, beraní spermie a DNA-bakteriofágy. Potvrdili, že šroubovitá struktura byla bezpochyby přítomna v biologicky aktivní DNA. Molekulární šroubovice se v té době náhle dostaly do popředí zájmu, když kalifornský profesor chemie Linus Pauling navrhl model šroubovice pro vystižení prostorového uspořádání polypeptidického řetězce v určitých bílkovinách. Proto se anglický fyzik Crick a americký biolog Watson začali zabývat vytvářením prostorového modelu šroubovice DNA z drátů a plíšků (tzv. terciární strukturu).

Pauling jim dal příklad, že již na základě teoretických předpokladů známých vzdáleností atomů a vazebných úhlů lze předpovědět prostorovou strukturu makromolekuly. Oběma vědcům přišly vhod údaje Wilkinse a Franklinové, které byly získány ohybem rentgenových paprsků. Podpořily jejich domněnku, že DNA musí mít strukturu šroubovice. Důležité bylo i chemické zjištění, že kyselý charakter fosfátových zbytků v "páteři" silně vyniká, zatímco zásaditý charakter bází je nějakým způsobem maskován. Watson a Crick proto dospěli k závěru, že se více pramenů DNA vine kolem sebe jako v copu, přičemž báze jsou namířeny dovnitř, kdežto fosfátové zbytky ční ven do vodního prostředí. Vlastní klíč však poskytlo Chargaffovo záhadné pravidlo o obsahu bází. Najednou bylo totiž jasně vysvětleno, když Watson a Crick zkoušeli model, ve kterém byly kolem sebe obtočeny dva prameny DNA. Uvažovali, že báze obou pramenů stojí ve stejné výši, téměř proti sobě a tvoří tak do jisté míry příčky točitého schodiště. V tomto případě mohly báze tvořit pravidelnou strukturu jenom tehdy, když proti bázi s dvěma heterocykly stojí báze s jedním heterocyklem (viz příloha 5). Pro dvě báze s dvěma heterocykly by bylo málo místa a pro dvě báze s jedním cyklem by zase zůstala mezera uprostřed. Tím se vysvětlilo, proč v kompletní molekule DNA je stejný počet bází s jedním heterocyklem a se dvěma heterocykly. Mezi dusíkovými a kyslíkovými atomy, které mohou vázat vodíkové atomy, vznikají při vzájemném přiblížení vodíkové můstky. Studium modelů DNA s použitím molekul bází ukázalo, že v molekule DNA mohou vodíkové můstky vzniknout pouze v párech adeninu s thyminem a guaninu s cytosinem, což plně odpovídalo Chargaffovu pravidlu.

Když byl v roce 1953 tento model zveřejněn na dvou stránkách anglického časopisu Nature, vzrušil všechny molekulární biology. Celková struktura byla pravidelná, podobná krystalu a přesto v ní mohlo být nekonečně mnoho variací, protože báze mohly podél šroubovice následovat v libovolném sledu.

Jakmile byl jednou zvolen sled bází v jednom prameni DNA, byl tím stanoven sled bází v druhém prameni. Podle pravidel párování bází musely být oba prameny k sobě komplementární. Tím se okamžitě nepřímo nabízel mechanismus, jakým se DNA identicky zdvojuje. Dvoušroubovice DNA rodičovské buňky se nejdříve rozepne jako zip a tím se rozvine na dva jednoduché prameny. Na tyto jednotlivé prameny se nyní napojí nízkomolekulární složky pro novou DNA, čtyři členy řetězce: A, T, G a C. Aby z oddělených rodičovských pramenů vznikly opět úplné dvoušroubovice DNA, musí se napojující stavební složky držet pravidel o párování bází. Připojené složky řetězce se nakonec spojí chemickými vazbami a vzniknou tak dvě nové molekuly DNA. Naděje Watsona a Cricka se těmito představami splnily. Jejich model nebyl jen popisem možného prostorového uspořádání makromolekuly DNA, ale umožnil též předpovědět, jak se tato molekula chová v živém organismu.

Jedna z těchto předpovědí se týkala osudu rodičovských pramenů DNA při identické replikaci. Kdyby syntéza nové DNA probíhala opravdu tak, jak jsme popsali a kdybychom dokázali rozlišit původní a nově syntetizovaný pramen DNA, měli bychom pozorovat následující sled syntézy DNA:

1.generace:          dvoušroubovice DNA, pramen starý-starý

2.generace:          pramen starý-nový, starý-nový

3.generace:          starý-nový, nový-nový, nový nový, starý-nový

Tento mechanismus replikace se nazývá semikonzervativní, protože se obě poloviny molekuly DNA (komplementární prameny) předají na potomstvo a na jejich matrici se budují nové komplementární prameny.

Experimentátoři měli za úkol nalézt mechanismus, jak rozlišit staré a nově syntetizované prameny DNA. Rozhodující pokus byl proveden v roce 1958. Krátce předtím zde byla vypracována metoda známá jako rovnovážná izopyknická sedimentace v hustotních gradientech. Při této metodě se vnese do vysoce koncentrovaného roztoku soli (obvykle chlorid cesia pro svoji vysokou rozpustnost), načež se provede odstředění ultacentrifugou. V důsledku vysoké odstředivé síly se sůl koncentruje na vnějších stranách nádoby. Hustota solného roztoku se tedy zvyšuje postupně od vnitřku směrem ven (pokud hřídel centrifugy považujeme za střed). Tento jev se nazývá hustotní gradient.

Je známo, že nadnášení tělesa ve vodě je závislé na hustotě solí v ní rozpuštěných. Makromolekuly budou v hustotním gradientu buď klesat nebo se vznášet, podle jejich vlastní hustoty a hustoty solného roztoku, v němž jsou ponořeny. Pokud dosáhnou místa, které odpovídá jejich vlastní hustotě, zůstanou tam. V hustotním gradientu tedy makromolekuly stejné hustoty zaujmou stejné místo. Méně husté makromolekuly zůstanou blíže u středu, hustější zůstanou dále od středu. Tohoto rovnovážného stavu se dosáhne až po 30 nebo více hodinách centrifugace. Podstatné je, že tím lze oddělit dva druhy makromolekul, které se od sebe liší hustotou jen velmi málo. Nyní lze zahájit pokus s replikací DNA. Baktérie byly vyživovány látkami, které místo normálního dusíku s atomovou hmotností 14 obsahovaly izotop dusíku s atomovou hmotností 15. Tento izotop není radioaktivní a je tedy stabilní. Zabuduje se do molekul DNA, jejíž báze jsou na dusík bohaté. Jakmile byla DNA tímto způsobem označena jako "těžká", jsou bakterie přeneseny do média s normálními živnými látkami, které obsahují dusík s atomovou hmotností 14. Od této chvíle je syntetizována DNA, která je "lehká". V různých intervalech tohoto pokusu jsou části kultury usmrceny, DNA z nich je extrahována a analyzována metodou hustotních gradientů. Místa, kde se DNA v gradientech koncentrovala, se stanoví podle absorpce UV záření.

Na začátku pokusu byla všechna DNA "těžká" (dvoušroubovice pramenů "starý-starý"). V první generaci po přenosu z "těžkého" do "lehkého" média nabyla DNA střední hustoty (dvoušroubovice pramenů "starý-nový"). Ve druhé generaci se vyskytlo stejné množství DNA střední hustoty (pramen "starý-nový") a lehké hustoty (pramen "nový-nový"). V dalších generacích se lehké DNA vyskytovalo stále více, ale současně přetrvávalo zhruba konstantní množství DNA střední hustoty, což znamená, že původní DNA se v první generaci spojuje se stejným množstvím nového materiálu, avšak v dalších generacích se již dále nerozděluje, což je přesně princip semikonzervativní replikace.

1.gen.                                                    1-1

2.gen.                                    1-2                            1-2

3.gen.                           1-3             2-3           1-3              2-3

4.gen.                      1-4    3-4    2-4    3-4   1-4    3-4    2-4    3-4

U DNA-bakteriofágů lze dobře ozřejmit dvoušroubovici DNA a rozdělení jednotlivých řetězců potomkům také čistě biologickou metodou. Některé chemikálie vedou k mutacím tím, že chemicky pozmění jednotlivé báze. Když je některá báze poškozena takovou chemikálií, zůstane komplementární báze nedotčena. Dojde k poruše v dvoušroubovici DNA, kdy se jednotlivé řetězce v obsahu informace liší. Biologicky může mít tato malá změna značné důsledky. Může se změnit typ lesí, které fág s pozměněnou bází vyvolává na bakteriálních koloniích. Tímto způsobem lze pozorovat replikaci DNA na další generace.

Nelze vyjmenovat všechny pokusy, ve kterých byl ověřován model DNA Watsona a Cricka. Všechny tyto pokusy však model jednoznačně potvrdily.

Při replikaci DNA je však třeba uvážit ještě jeden problém. Pokud má dojít k replikaci, dvoušroubovice DNA se musí rozvinout, tedy rodičovská dvoušroubovice musí rotovat. Ze známé rychlosti syntézy DNA a ze známého počtu závitů na jednotce délky lze vypočítat rychlost této rotace. Ukazuje se, že jde o rychlost několika tisíc otáček za minutu, což je hodnota velmi vysoká a rotační pohyb v biologických procesech není běžný. Fyzikové však ujišťují, že síly, které se při rotaci uplatňují, jsou v rámci možností. Odstředivá síla při takové rychlosti rotace je minimální, protože poloměr dvoušroubovice DNA je velmi malý. Nikdo však zatím nenašel metodu, jak teoreticky předpovězenou rotaci skutečně pozorovat.

DNA je makromolekula s výjimečnými vlastnostmi. Jde o nosič informací, který slouží jako matrice pro syntézu sebe samé. Tím se otevřely zcela nové výhledy, ale zůstaly otázky klasické biochemie. Které enzymy řídí syntézu DNA? Odkud se získává energie pro tuto syntézu?

Aby získali odpovědi na tuto otázku, začali biochemikové DNA syntetizovat ve zkumavce s použitím buněčných extraktů. Americký biochemik Kornberg byl první, kterému se to podařilo. Použil bílkovinných extraktů z baktérií Escherichia coli a různých DNA jako matric. Bílkovinné extrakty měly požadovanou enzymovou aktivitu a ta umožnila vznik DNA z nízkomolekulárních stavebních složek. Typ stavebních složek potřebných k syntéze zodpověděl také otázku, kde se získává potřebná energie. Jednotlivá stavební složka DNA je složena s dusíkaté báze, desoxyribosy a fosfátového zbytku. Enzym však byl aktivní pouze v případě, že byla použita stavební složka obsahující místo fosfátového zbytku trifosfátový zbytek. Většina biosyntetických procesů v buňce používá ATP jako potřebný zdroj energie. V případě syntézy DNA odštěpení dvou fosfátových zbytků poskytuje nezbytnou energii.

Po vyčištění Kornbergova skupina získala enzym, který byl nazván DNA-polymerasa. Pomocí tohoto enzymu byla ve zkumavce připravena celá DNA jednoho DNA-bakteriofágu, a to v biologicky aktivní formě. Zdálo se, že byl získán molekulární nástroj, kterým živá buňka provádí množení a zachování své dědičné výbavy. Skutečnost však byla překvapující.

Kdyby byl Kornbergův enzym DNA-polymerasa skutečně zodpovědný za replikaci, musely by bakteriální mutanty, u nichž je tento enzym defektní, úplně ztratit schopnost se množit. Ve skutečnosti se však podařilo tyto mutanty izolovat a pěstovat. Důležité bylo pozorování, že kmeny s pozměněným Kornbergovým enzymem byly velmi citlivé na světlo. Jak později ještě vysvětlíme, toto pozorování ukazovalo na to, že Kornbergův enzym neprovádí replikaci DNA, ale opravuje poškození, které bylo způsobeno v DNA působením UV záření. Toto poškození bez oprav by vedlo k uhynutí buňky a proto jsou reparační enzymy životně důležité při silném světelném záření, nikoliv však za tmy nebo za slabého světla. Molekulární biologové a biochemici chtěli ve zkumavce napodobit životní pochody, avšak museli mít stále na zřeteli možnost, že umělé reakční systémy mohou vést k omylům. V případě DNA-polymerasy bylo překvapivé to, že tento enzym mohl zřejmě vykonat mnohem více ve zkumavce (syntetizovat celou DNA) než byl schopen za normálních podmínek v buňce.

Když se tato zpráva z laboratoře v Cold Spring Harboru na ostrově Long Island u New Yorku rozšířila do světa, začal hon na "pravou" DNA-polymerasu. Bylo pravděpodobné, že se tento enzym nenachází jako volně rozpuštěná bílkovinná molekula, ale že je vázán na buněčnou membránu. To by totiž vysvětlovalo, proč tento enzym nebyl k nalezení, neboť většina dělících metod v biochemii funguje jen tehdy, pokud pracujeme s rozpuštěnými látkami. Brzy se zjistilo, že vedle Kornbergova enzymu existují v buňkách E.coli ještě další enzymy typu DNA-polymerasy.

Pracovní skupiny v Tubingen a v Kalifornii nakonec izolovaly "pravý" DNA-replikační enzym a označily jej jako DNA-polymerasa III. Na rozdíl od Kornbergova enzymu je DNA-polymerasa přítomna v buňce jen v nepatrném množství. Na jednu buňku E.coli připadá pouze asi šest molekul enzymu. Biologicky však tento nález nepřekvapuje, protože v buňce je pouze několik záchytných bodů pro DNA, na kterých může enzym účinkovat. Nečekaný však byl objev značného množství pomocného proteinu, který se účastní replikace DNA, tzv. "rozvíjející" bílkoviny. Nemá však žádnou enzymovou aktivitu ale připravuje však práci enzymu tím, že se váže na řetězce DNA a rozvíjí dvoušroubovici. Na oddělené řetězce se mohou podle Watson-Crickových pravidel napojovat báze ještě dříve, než přijde polymerasa III, aby je mezi sebou spojila. Enzym může proto mnohem rychleji pracovat, než kdyby musel čekat na přísun určité složky difúzí. Ve skutečnosti je rychlost, s jakou řetězce DNA rostou v živých organismech, překvapivě vysoká.

Na rozdíl od jednoduché a všeobecně platné struktury DNA přinášejí výzkumy syntézy DNA i u organismu, jakým je E.coli, překvapivé a vzájemně nesouvisející poznatky. Objevují se další pomocné enzymy, které vedle DNA-polymerasy III a "rozvíjejícího" proteinu spolupracují na replikaci DNA. Některé druhy episomů se v téže buňce zmnožují jiným mechanismem než chromosomální DNA. Dále pak je syntéza DNA svázána se syntézou RNA a bílkoviny, zatím však neznámým způsobem.

Jak je informace v DNA uložena, jaký má význam a jak se předává? Pravidlo "jeden gen, jeden enzym" říká, že alespoň část informace určuje určitou strukturu bílkovin, které potom svými katalytickými účinky řídí látkovou výměnu. Opět to byla dvojice baktérie a bakteriofág, které vděčíme za objev skutečnosti, že tento přenos informace není přímý, ale probíhá určitou oklikou.

Již víme, že DNA se identicky zdvojnásobuje a alespoň v hrubých rysech rozumíme molekulárnímu mechanismu, kterým je dědičná informace předávána na další generaci. V každé generaci však musí dojít k využití dědičné informace. Pravidlo "jeden gen, jeden enzym" říká, že toto využití spočívá v syntéze bílkovin. Rostoucí buňka musí sestavovat tisíce různých druhů bílkovin, přičemž každá z bílkovin má jiný sled aminokyselin a tím i zcela určitou enzymovou aktivitu nebo stavební funkci. DNA, která obsahuje informace pro syntézu bílkovin, je umístěna v jádře buňky, vlastní syntéza probíhá v cytoplasmě. Některé buňky, např. červené krvinky savců, dokonce ztrácejí buněčné jádro a přesto však pokračují v syntéze bílkovin, v tomto případě bílkoviny hemoglobinu. Bílkoviny se tedy netvoří přímo na matrici DNA, ale zřejmě existuje jistý přenašeč genetické informace.

Vzhledem k malé velikosti bakteriální buňky nemůžeme prokázat prostorové oddělení míst, kde se vytváří DNA a kde bílkoviny. Když francouzští vědci Jacob a Monon uvažovali o způsobu, jakým bakteriální buňka přizpůsobuje syntézu různých enzymů měnící se nabídce živných látek z okolí, napadla je myšlenka, že existuje makromolekula pro přenos genetické informace.

Již jsme diskutovali o tom, že bílkoviny nejsou vhodnými kandidáty pro udržování a přenos informace pro tvorbu jiné bílkoviny. Zřejmě musí existovat nějaké enzymu k tomu, aby se aminokyseliny spojily v nové peptidické řetězce. Budou nutné další bílkoviny, které budou udržovat ve správném pořadí všechny účastníky syntézy bílkovin. Informace, které aminokyseliny se mají spojit, však zřejmě bude uložena v nukleových kyselinách. Jacob a Monod přednesli hypotézu, že molekulárními přenašeči informace jsou ribonukleové kyseliny. Z biochemických pozorování vyšších buněk bylo totiž známo, že v cytoplasmě je obsaženo množství různých ribonukleových kyselin a že tyto ribonukleové kyseliny vznikají v jádře buňky.

Ribonukleové kyseliny RNA na rozdíl od DNA obsahují v nukleotidech ribosou a místo báze thymin obsahují bázi uracil. Ve většině případů se RNA vyskytuje jako jednopramenná molekula, která však může mít sekundární (plošnou) strukturu. RNA ve viru tabákové mozaiky dokazuje, že RNA může být nositelem genetické informace stejně, jako DNA. Lze si také představit, že RNA převezme genetickou informaci od DNA. DNA obsahuje informaci v každém ze svých dvou řetězců. Po rozvinutí dvoušroubovice může jeden řetězec DNA posloužit jako matrice pro syntézu RNA.

V roce 1940 zkoumal Švéd Caspersson v mikrospektrofotometru různé buněčné typy a došel k závěru, že buňky, které výrazně syntetizují bílkoviny, obsahují velké množství RNA. Jde např. o buňky slinivky břišní, které syntetizují trávicí enzymy a exportují je do tenkého střeva. O několik let později ukázala pozorování pod elektronovým mikroskopem, že tyto buňky obsahují velice mnoho ribosomů. Ribosomy obsahují asi dvě třetiny RNA a zbytek tvoří různé bílkoviny. Nabídla se hypotéza, zda ribosomy mají souvislost s přenosem genů k místům proteosyntézy.

Zjistilo se, že v ribosomech probíhá syntéza bílkovin. Hypotéza mohla být ověřena na modelovém systému, u baktérií infikovaných T-fágy. Co se stane, když T-fágy infikují buňku E.coli? Genetický materiál fágů, tedy jejich DNA vznikne do buňky hostitele a vyvolá tam tvorbu celé řady bílkovin, částečně enzymů, které řídí syntézu nové fágové nukleové kyseliny a částečně strukturálních bílkovin pro výstavbu nových fágů. Jde tedy o specifické "fágové" bílkoviny, které se nikdy nevyskytují v neinfikované buňce E.coli. Má-li být syntéza bílkovin "specifických" pro buňku E.coli změněna na syntézu bílkovin "specifických" pro fágy, je k tomu zapotřebí nových ribosomů s novou RNA?

Na tuto otázku odpovídají přímo T2-fágy. Jakmile proniknou do buňky, okamžitě zastaví syntézu nových ribosomů a syntézu ribosomální RNA. Syntéza bílkovin nového typu musí tedy probíhat na již existujících ribosomech. Z toho ovšem vyplývá, že ribosomy jsou pouze pracovními jednotkami pro syntézu bílkovin, ale neobsahují návod, jaké aminokyseliny a v jakém sledu mají být spojeny. Když nabídneme radioaktivní prekursory RNA buňkám, které jsou naočkovány fágy, prokážeme jiný druh RNA, která je zřejmě velmi rychle syntetizována a velmi rychle odbourávána. To byla přesně ta vlastnost, kterou Jacob a Monod vyžadovali od mediátorové neboli informační RNA, neboť při změněných podmínkách umožní rychlou změnu programu syntézy bílkovin v buňce. Složení bází této RNA naznačovalo, že zřejmě odpovídá úsekům fágové DNA a nikoliv bakteriální DNA.

O několik let později vynalezli Američané Spiegelman a Hall testovací metodu, kterou bylo možné prokázat, že hledaná RNA je informační RNA fágů, tedy že má sled bází jako určitý úsek fágové DNA. Metoda se nazývá hybridizace nukleových kyselin představuje geniální využití Watson-Crickova modelu. Vodný roztok DNA se zahřeje na více než 80 stupňů Celsia, čímž se dosáhne rozvinutí dvoušroubovice. Tepelný pohyb atomů je totiž silnější než síly, které udržují vodíkové můstky mezi bázemi. Takto denaturovaná DNA se naváže na nějaký nosič, např. na agarový gel, čímž se zabrání zpětnému utvoření dvoušroubovice. Nyní se přidá radioaktivní RNA a směs se mírně zahřeje. Molekuly RNA jsou malé a volně se pohybují neuspořádaným difúzním pohybem a přitom se náhodně setkávají se zakotvenými jednotlivými prameny DNA. Pokud nemají podobný sled bází, nejsou zachyceny. Jestliže však molekula RNA nalezne řetězec DNA s komplementárním sledem bází, zachytí se na molekule DNA podle Watson-Crickova principu. Po čase lze z roztoku vymýt tu část RNA, která nenalezla komplementární řetězce. RNA, která zůstane na nosiči může být kvantitativně změřena pomocí její radioaktivity.

Pokud smísíme v kontrolních pokusech RNA z E.coli s DNA z telecího thymu, nedojde k hybridizaci. Rovněž nedojde ke spojení, pokud smísíme RNA z E.coli s fágovou DNA. Avšak RNA z telecího thymu hybridizuje z DNA z telecího thymu, RNA z E.coli hybridizuje s DNA z E.coli. Vyhledávání komplementárních bází je zřejmě velmi precizní proces, při němž lze měřit "příbuznost" obou nukleových kyselin. Pokud testujeme radioaktivně značenou RNA z infikovaných buněk E.coli s fágovou DNA, zjistíme silnou hybridizaci. Tato RNA tedy obsahuje sledy bází, které jsou komplementární k úsekům jednoho pramene fágové DNA. Tím bylo prokázáno, že DNA-fágy skutečně tvoří informační RNA a jejím prostřednictvím realizují svoji genetickou informaci.

Informační RNA však existuje i v normální buňce, která nebyla očkována virem. Je rychle odbourávána a proto se nevyskytuje ve velkém množství. Při krátkodobém podání radioaktivních prekursorů se tato RNA silně označí, neboť se vytváří rychleji než jiné typy RNA. Jak lze očekávat, jde o směs molekul různé délky, což odpovídá různým pokynům pro různé bílkoviny.

Nyní chybí ještě důkaz, že informační RNA se skutečně dostane k místům proteosyntézy, k ribosomům a naváže se na ně, aby sled bází mohl být přeložen a určil tak strukturu nově vytvářených bílkovin. Při velmi opatrné extrakci ribosomů z buněk zjistíme, že ribosomy nejsou volné, ale vytvářejí shluky. Přidáme-li nepatrné množství enzymu ribonukleasy, která odštěpuje RNA, rozpadnou se tyto shluky na jednotlivé ribosomy. To ukazuje, že ribosomy byly zřejmě vázány vláknem RNA. Pokud tyto shluky ribosomů (polyribosomy) přemístíme na síťku a prozkoumáme elektronovým mikroskopem, zjistíme, že se ribosomy jeví jako řetízek perel spojených vláknem RNA. Polyribosomy byly pozorovány nejprve v červených krvinkách, později v mnoha jiných živočišných a rostlinných buňkách a baktériích. Pokusy s radioaktivním značením prokázalo, že vlákno RNA představuje informační RNA. Více ribosomů současně "čte" tentýž program a putuje podél informační RNA.

Ikdyž těmito pokusy byla prokázána existence informační RNA ve všech říších organismů, je u vyšších organismů ještě mnoho nejasného. Je známo, že informační RNA u vyšších organismů nemá tak krátký poločas života, jako je tomu u baktérií, u kterých existuje jen několik minut. U rostlin a živočichů má tato RNA životnost několik hodin až několik dní.

Podařilo se izolovat ze živočišných buněk informační RNA pro některé dobře známé bílkoviny. Např. z nezralých červených krvinek byla izolována informační RNA pro syntézu bílkovinné složky hemoglobinu. Biologická aktivita, tedy schopnost řídit tvorbu příslušní bílkoviny, byla ověřena dvěma metodami. Jednak v bezbuněčném proteosyntetickém systému ve zkumavce a jednak po vstříknutí RNA do žabí vaječné buňky, která cizí RNA přijme a vytvoří příslušnou bílkovinu. V buněčném jádře nezralých červených krvinek byly hybridizační metodou prokázány úseky DNA, které byly komplementární ke studované RNA.

Jakou úlohy hrají RNA-viry ve světle uvedených poznatků? Všechno svědčí pro to, že genetický materiál těchto virů je identický s informační RNA. Pokud extrahujeme RNA přímo z vyčištěných virových částic a přidáme ji k extraktu z buněk hostitele, začně ihned řídit syntézu bílkovin.

Stejně jako u DNA je nutné u RNA zodpovědět otázku, jak probíhá její syntéza. Prokázalo se, že syntézu RNA lze provést ve zkumavce. Je k tomu potřeba stavebních složek RNA, tedy trifosfáty ATP, UTP, GTP a CTP a DNA, která funguje jako matrice pro nově vznikající RNA. Konečně je nutný enzym DNA-dependentní RNA polymerasa. RNA polymerasy se vyskytyjí v jadérku a v cytoplasmě (mitochondriích) buněk vyšších organismů. RNA polymerasa z baktérie E.coli byla vyčištěna a detailně prozkoumána. Tento enzym používají také DNA-fágy, které pronikají do buňky, aby alespoň na začátku infekčního cyklu vyrobily svoji vlastní informační RNA. Protože DNA-fágy lze získat vysoce vyčištěné a nepoškozené, lze je použít jako modelový systém na němž můžeme studovat syntézu informační RNA ve zkumavce. Při pokusech na tomto systému se potvrdila domněnka, že v určitém úseku matrice DNA se "přepíše" pouze jeden z řetězců DNA, kdežto druhý nese stejnou informaci v komplementárním tvaru. Kromě toho se ukázalo, že začátek a konec genů nebo genových skupin na DNA musí být označen. RNA polymerasa začíná přepis pouze od určitých bodů DNA a rovněž končí jen v určitých bodech. Při tomto molekulárním rozpoznávacím procesu pomáhají RNA polymerase ještě další bílkovinné faktory, které např. určují, které geny se mají zpracovat nejdříve.

U RNA-virů probíhá tvorba nové RNA nikoliv na matrici DNA, ale RNA. Podle našich současných znalostí takový proces neprobíhá v normální neinfikované buňce. RNA-viry tedy nemohou použít enzym, který je přítomen v hostitelských buňkách. Viry přimějí hostitelskou buňku k tvorbě RNA-dependentní RNA polymerasy neboli virové replikasy.

Syntéza bílkovin a nukleových kyselin tedy probíhá podle schématu [E1].

Podstatné je, že informace se může předávat pouze od nukleových kyselin k nukleovým kyselinám a bílkovinám, nikoliv od bílkovin k nukleovým kyselinám. Při přenosu informace z nukleové kyseliny na nukleovou kyselinu hovoříme o přepisu (transkripci), při přenosu informace z nukleové kyseliny na bílkoviny hovoříme o překladu (translaci).

                                                                                         - pokračování -

časopis o přírodě, vědě a civilizaci