Hypotéza, že dědičné faktory působí jako molekulární matrice, se mohla ověřit až po osvětlení jejich chemické povahy. Tohoto cíle se dosáhlo posléze dvěma nezávislými cestami. Obě vedou do oblasti původců nemocí a k nejnižším strukturálním stupňům života.

Pneumokoky jsou baktérie, které jsou původci onemocnění zápalem plic, pneumonie. Pokud vpravíme do těla myši kulturu pneumokoků, myš onemocnění a po čase uhyne. V laboratoři bylo pozorováno, že existují pneumokokové kmeny, které onemocnění vyvolávají a kmeny, které onemocnění nevyvolávají. Tyto kmeny lze odlišit podle vzhledu kolonií na agarových plotnách. Nebezpečné kmeny tvoří hladké lesklé kolonie, kolonie neškodných kmenů mají povrch drsný. Zprvu se takový vztah mezi tvarem kolonií a schopností vyvolat onemocnění, jevil jako překvapující. Mikroskopické pozorování ukázalo, že morfologický rozdíl má velmi jednoduchý biochemický základ. Zatímco patogenní formy mají sliznatý obal, pouzdro s polysacharidů, ztratily nepatogenní formy schopnost tento sliz produkovat. Jejich nechráněné buňky pak nejsou schopny se v organismu oběti rozšiřovat.

V roce 1927 uveřejnil britský vědec Griffith velmi zvláštní nálezy u pneumokoků. Jestliže byly do těla myši vpraveny teplem usmrcené "hladké" pneumokoky, zůstala myš naživu. Pokud byly do těla myši vpraveny "drsné" pneumokoky, myš zůstala také naživu. Jestliže však vpravil do těla myši současně "drsné" a teplem usmrcené "hladké" pneumokoky, myš zakrátko uhynula, jako kdyby ji očkoval živými "hladkými" pneumokoky. Překvapující také bylo, že z krve mrtvých myší bylo možno izolovat živé "hladké" pneumokoky a kultivovat je na Petriho miskách. Byly tak získány bakterie, které nebyly do těla myši vůbec vpraveny. Již víme, že viditelná bakteriální kolonie se skládá z miliónů buněk, které pocházejí z jediné mateřské buňky. Pokud se bakteriální buňky bez pouzder přeměnily v přítomnosti mrtvých opouzdřených buněk, pak musí jít o dědičnou přeměnu, protože i potomci bakterií izolovaných z mrtvé myši mohli tvořit pouzdra. Tento trvalý přenos dědičných znaků byl označen jako transformace.

Předpokládalo se, že schopnost tvořit pouzdra, kterou ztratily "drsné" kmeny pneumokoků, je potenciálně uložena v těchto buňkách a lze ji aktivovat transformačním agens. Transformace by byla tedy jen vyvoláním tvorby pouzdra a nikoliv přímým přenosem instrukce pro tvorbu pouzdra. Tuto možnost mohl Griffith vyloučit tím, že použil různé opouzdřené druhy pneumokoků. V lékařské bakteriologii bylo již dlouhou dobu známo, že pneumokokové kmeny různého původu tvoří pouzdra složená z různých polysacharidů. Z každého "hladkého" typu mohl vzniknout "drsný" typ tím, že ztratil schopnost vytvářet pouzdro. Tyto mutanty však byly v některých případech reverzibilní a při tom vznikl ten opouzdřený typ, který měl mateřský kmen. Griffithovi se podařilo přenést takovým ztrátovým mutantám nový typ pouzdra, který jeho opouzdření předchůdci netvořili. Použil jako dárce usmrcené bakterie požadovaného typu. Podle výsledku to vypadalo tak, jako by živé bakterie převzaly od mrtvých opuzdřených bakterií schopnost tvořit příslušné pouzdro. Griffith se domníval, že se přenáší polysacharid pouzdra. Pozoruhodné bylo, že látka pouzdra mohla vyvolávat vlastní syntézu v mnoha generacích.

Transformace pneumokoků se jevila mnoha vědcům jako mikrobiologický okultismus. Bylo jen málo těch, kteří brali vážně Griffithovy výsledky. Zaměřili však své vlastní výsledky tímto směrem a potvrdili jeho nálezy a také se o něco přiblížili k řešení záhady. Pokud byly mrtvé "hladké" a živé "drsné" pneumokoky smíšeny v kultivačním médiu ve zkumavce a za nějakou dobu vysety na Petriho misky, vyrostly pouze kolonie "hladkých" pneumokoků. Vzorky z těchto kolonií měly schopnost usmrtit myši.

Logicky bylo možno vysvětlit transformaci také tím, že živé baktérie bez pouzdra nepřejímají od mrtvých opouzdřených buněk nějakou informaci, ale probudí je k životu. Tato dosti nejistá možnost "znovuoživení" byla s konečnou platností vyloučena tím, že se místo mrtvých buněk použilo buněčného extraktu. Ten se získal zfiltrováním přes speciální keramický filtr, který nepropouští baktérie. Jednoznačně se prokázalo, že "odkazem" mrtvých opouzdřených pneumokoků je nějaká látka, kterou lze určit biochemickými metodami.

Odhalením této látky se začal zabývat tým O. A. Averyho z Rockfellerova ústavu v New Yorku. Avery vypracoval test na její biologickou aktivitu. Stejně jako Griffith sledoval přenos nového pouzderního typu na pneumokoky, které ztratily předtím schopnost tvořit pouzdro vlastního typu. Použil však nové techniky, transformace prostřednictvím bezbuněčného extraktu dárcovských baktérií. Jeho plán výzkumu byl asi následující:

1.krok: kmen s pouzdrem typu II ----> kmen bez pouzdra

2.krok: kmen bez pouzdra + extrakt z opouzdřeného kmene typu III ----> opouzdřené potomstvo typu III

3.krok: kmen bez pouzdra + část transformačního extraktu ----> opouzdřené potomstvo ?

Avery a jeho spolupracovníci začali intenzivně pracovat na vyčištění transformační látky. Pěstovali kultury dárcovských buněk v obrovských láhvích, centrifugací shromažďovali baktérie a usmrcovali je zahřátím. Avšak již z nejstarších pokusů o transformaci bylo zřejmé, že mírné teplo neuškodí transformační látce. Protože mnohé bílkoviny se teplem srážejí a enzymy ztrácejí touto denaturací svoji aktivitu, předpokládalo se, že transformační agens není bílkovina nebo enzym. V dalších stupních čištění byly proto odstraněny z preparátu všechny bílkoviny. Zjistilo se, že transformační vlastnost zůstala zachována. Rovněž se nepotrvdila Griffithova myšlenka, že jde o polysacharid pouzdra. Některými enzymy byl polysacharid odbourán a produkt štěpení byl odstraněn a přesto se transformační schopnost neztratila. Opakovanou precipitací alkoholem získali badatelé posléze viskosní látku, která neobsahovala znečištěniny ve větším množství a chemicky byla identifikována jako desoxyribonukleová kyselina. Tato látka se skládá z obrovských vláknitých molekul, které bylo možno navinout na skleněnou tyčinku při jejím otáčení v roztoku.

Desoxyribonukleová kyselina byla biochemikům známa několik desetiletí - viz příloha 5. Její objevitel, Friedrich Mieschner, určil kyselý charakter této "buněčné" kyseliny, ale neurčil její velikost. Použil extrakčních metod, které vedly k rozštěpení molekuly na krátké úseky. Desoxyribonukleová kyselina (dále jen DNA) byla později nalezena v chromosomech. V průběhu osmi desetiletí však nezískala velkou popularitu, neboť jí nikdo nepřipisoval nějakou důležitou biologickou funkci. Teprve Avery izoloval tuto látku a prokázal, že může u bakterií přenést dědičnou vlastnost, schopnost tvořit pouzdra.

Namítalo se však, podobně jako v případě čištění a krystalizace enzymů, že biologicky aktivní není izolovaná DNA, ale nějaká příměs, přítomná v nepatrných stopách. Aby Avery tuto námitku vyloučil, testoval, které látky mohou zničit biologickou aktivitu jeho preparátu a které jsou neúčinné. Enzym, který odboural polysacharid pouzdra, nezměnil biologickou aktivitu preparátu. Rovněž neúčinný byl trávicí enzym trypsin, který štěpí bílkoviny. Tím se vyloučilo, že pouzderní polysacharid nebo bílkoviny jsou vedlejšími biologicky aktivními látkami. V té době byl izolován ze střevní sliznice enzym, desoxyribonukleasa - viz příloha 10., který byl schopen zničit schopnost transformace v Averyho preparátech. Účinek tohoto enzymu spočívá v tom, že rozloží vláknité molekuly DNA na malé kousky, což se fyzikálně projevilo tím, že roztok ztratil svoji viskositu. Avery a jeho spolupracovníci si mohli být jisti, že objevili biochemickou podstatu transformační látky. Soukromě se však Avery v roce 1945 vyjádřil v tom smyslu, že bude ještě třeba mnoho práce, než přesvědčí své vědecké kolegy, že DNA není jen netečnou součástí buněk. Avery měl pravdu, protože uvedený základní objev molekulární biologie byl plně uznán až po jeho smrti.

Desoxyribonukleovou kyselinu lze snadno získat například z čerstvých sleďů. Friedrich Mieschner byl první, koho napadlo, že rybí spermie jsou vhodným výchozím materiálem. V roce 1871 použil rýnské lososy, kteří dnes již zcela vymizeli. Dále popisovaná extrakce DNA je velmi hrubou a zjednodušenou modifikací Averyho metody. Nemůžeme sice doma podat biochemický nebo biologický důkaz, ale na spektrálním fotometru by se prokázalo, že získaná látka má ultrafialové spektrum typické pro nukleové kyseliny.

Pokud chceme "podomácku" připravit DNA, vezmeme polovinu mlíčí z čerstvého sledě (obsahuje spermie) a rozšleháme je vidličkou v polovině šálku vařící vody a ihned odstraníme z plamene. Přidáme trochu prostředku na mytí nádobí jako detergens. Okamžitě nastane zhoustnutí (vlákna na vidličce), což znamená, že byly rozpuštěny buněčné membrány a uvolnila se DNA. Zchlazený roztok zfiltrujeme přes čajové sítko do sklenice, přičemž DNA pomalu odkapává, zatímco v sítku zůstávají různé zbytky. Do sklenice vmícháme půl šálku lihu. DNA se oddělí od tekutiny jako bílá vláknitá hmota. Zfiltrujeme ji přes papírový filtr. Hmota DNA, která zůstane na filtru se vidličkou přenese na čistý filtr a usuší se na vzduchu. Konečný produkt není vynikající kvality, ale je to DNA.

Vraťme se ke genetickému výzkumu transformace. Averyho pokus v mnohém připomíná vyvolávání mutací. Z formálního hlediska lze DNA považovat za látku zodpovědnou za mutace. Pokud se týče manipulace s dědičnou výbavou, jde transformace dále. Na rozdíl od naprosto neřízené mutace může vědec na začátku transformačního pokusu zajistit jeho usměrnění. Tak mohl Avery určit pouzderný typ příjemce tím, že extrahoval DNA z bakterií, které měly příslušný typ pouzdra. Předem mohl konstatovat, že potomci budou mít schopnost vytvářet pouzdra typu III. Avšak ze dvou hledisek je transformace stále ještě věcí náhody. Za prvé jenom málo buněk se transformuje k tvorbě pouzdra a nelze předpovědět, které buňky to budou. Za druhé se přenese mnoho jiných částí DNA, tedy nejen ta, která obsahuje dědičný faktor pro tvorbu pouzdra. V Averyho pokusu se to však neprojevilo, neboť buňky dárce i příjemce byly ve všech ostatních vlastnostech identické. Další pokusy však ukázaly, že např. mutace vedoucí k biosyntetickým defektům mohou být vyléčeny transformací, pokud dárcovský kmen měl ještě zachován příslušný znak, resp. schopnost. Dojem, že jde o plně programovaný průběh transformace, vzniká tedy především z toho, že experimentátor má z technických důvodů na zřeteli pouze jeden nebo málo znakových rozdílů. Od roku 1970, kdy se podařilo oddělit jeden bakteriální gen od ostatních dědičných faktorů, existuje naděje, že se podaří při výběru přenášeného genu vyloučit náhodnost.

Zcela nezávisle na pokusech Griffitha a Averyho s pneumokoky se objevila jiná stopa vedoucí k nukleovým kyselinám. Na tabákových polích jižního Ruska se koncem 19.století rozšířila velmi nakažlivá nemoc, která vyvolávala na tabákových listech žlutavé skvrny a často mrzačila dorůstající listy. Vysoká infekčnost byla prokázána jednoduchým pokusem. Pokud byl nakažený list rozdrcen a kapka extraktu byla přenesena na zdravou rostlinu, tato rostlina onemocněla během několika dní. Totéž se stalo, když se extrakt zředil stokrát, tisíckrát i desetitisíckrát. Jediným tabákovým listem bylo možno nakazit celé tabákové pole. Protože původce nemoci nebyl viditelný pouhým okem, předpokládalo se, že jde o baktérie. Ve Zprávách Petrohradské akademie věd popsal však ruský biolog Ivanovskij pod titulem "O skvrnité nemoci tabákových rostlin" podivuhodný výsledek pokusu. Nakažené listy byly vylisovány a šťáva byla filtrována přes bakteriologický sintr, který bakterie nepropouští. Tekutinou, která prošla filtrem byly infikovány zdravé rostliny a ty překvapivě onemocněly. Ivanovskij uvážil dvě možnosti. Buď je původce choroby velice malý, menší než bakterie, nebo byla vada v sintrech. O něco později rozpoznal holandský mikrobiolog Beijerinck po pečlivě provedených pokusech, že původce tabákové choroby je skutečně menší než nejmenší bakterie. Bylo rozpoznáno mnoho dalších nemocí, jejichž původci byli zařazeni do zvláštní skupiny "filtrovatelných virů" (lat. virus = jed). První podrobněji zkoumaný zástupce této skupiny dostal jméno virus tabákové mozaiky (TMV).

Jeden fytopatolog (odborník pro výzkum chorob rostlin) později zjistil, že tzv. javanský tabák (odrůda tabáku Nicotina glutinosa) nereagoval na infekci TMV tvorbou mozaiky, ale na listech vznikla mnohá drobná ostře ohraničená infekční ložiska, tzv. "lese". Počet těchto lesí na listu bylo měřítkem pro schopnost roztoku TMV vyvolat chorobu. To dodalo odvahu americkému chemikovi Stanleymu, aby začal izolovat původce nemoci. Právě v té době, kolem roku 1930, bylo připraveno mnoho enzymů v čistém a krystalickém stavu. Stanley se domníval, že TMV je látka podobná enzymu, jejíž účinek spočíval v tom, že v hostitelské buňce vyvolá produkci stejných molekul, z nichž je složena. Stanley si neuvědomil, že taková představa je již sama paradoxem.

Stanley nechal infikovat celé tabákové pole. Získal vědra vylisované šťávy a dělil ji metodami, které se osvědčily při čištění enzymů. Hrubé zbytky buněk odstraňoval filtrací šťávy přes gázu. Chloroplasty z roztoku odstředil a nakonec vysrážel infekční látku přidáním soli a tak ji zkoncentroval.

Všechny pracovní postupy kontroloval testem výskytu lesí. Získal nakonec bezbarvý mléčný roztok, který byl vysoce infekční. Rozpuštěná látka dokonce za určitých podmínek krystalizovala. Chemická analýza ukázala, že jde o bílkovinu, k velké spokojenosti Stanleyho. Stanley dospěl k závěru, že krystalická bílkovina má schopnost množit se, ikdyž jen jako parazit. Protože se vyskytovaly různé kmeny TMV, tedy dědičné rozdíly, byla připsána této látce schopnost být nositelkou dědičnosti. Velmi brzy se však objevily pochybnosti, zda skutečně jde o pravé, trojrozměrně uspořádané krystaly. Navíc se ukázalo, že fosfor, který Stanley považoval za nečistotu, tvořil u jiných rostlinných virů konstantní část, ikdyž typické bílkoviny fosfor neobsahují. Problém nebyl tak jednoduchý, jak Stanley doufal. Ve viru TMV bylo 5% ribonukleové kyseliny obsahující fosfor. Nabízely se tři možnosti, které se musely prozkoumat. Schopnost reprodukce celé virové částice má bílkovina viru, nukleová kyselina nebo je zapotřebí obou částí.

Rozhodnout bylo možno až o 20 let později díky technickému pokroku v chemických separačních metodách pro nukleové kyseliny. Pracovní skupině Gerharda Schramma v Tubingen se v roce 1956 podařilo rozložit virus a izolovat nukleovou kyselinu. Test lesí ukázal, že infekční byla nukleová kyselina. Naproti tomu samotná bílkovina TMV infekční nebyla. Nejrůznější činidla, která inaktovala virovou bílkovinu nebo celý virus, neovlivnila infekčnost nukleové kyseliny. Enzym ribonukleasa - viz příloha 10. však infekčnost během několika minut zrušil. Z tabákových rostlin, které byly infikovány nukleovou kyselinou, bylo možno extrahovat potomstvo úplných virových částic. Sama nukleová kyselina tedy byla schopna syntetizovat novou nukleovou kyselinu a novou bílkovinu v rostlinné buňce.

Objevila se námitka, že tato tzv. virová bílkovina je vlastně rostlinná bílkovina, která se nachází v tkáni zdravých rostlin a pouze obaluje množící se nukleovou kyselinu viru. Vědci v Berkeley vyloučili tuto možnost pokusem. Měli k dispozici dva přírodní kmeny TMV, které se značně odlišovaly ve vlastnostech bílkovinného obalu. První kmen (A) byl původně izolován z tabáku, druhý kmen (B) pocházel z jitrocele prostředního.

Badatelé rozložili oba typy na bílkovinu a nukleovou kyselinu. Ve zkumavce opět sestavili virové částice, ovšem tak, že ribonukleová kyselina (RNA) kmene B dostala obal kmene A a obráceně. Těmito virovými částicemi pak infikovali tabákové rostliny. Výsledkem bylo, že nezáleželo na tom, jaký bílkovinný obal měla virová částice před infekcí. Jako potomstvo vznikly vždy částice kmene A s bílkovinným obalem kmene A a částice kmene B s bílkovinným obalem kmene B. Tento pokus jednoznačně potvrdil, že výlučně nukleová kyselina TMV určuje vlastnosti potomstva viru a současně, že bílkovina viru není rostlinnou bílkovinou.

Infekce tabákové rostliny pomocí RNA a transformace baktérií pomocí DNA lze společně charakterizovat tím, že v obou případech lze přenést dědičné znaky na živé buňky chemicky čistými roztoky nukleových kyselin. U bakteriálního pokusu byly přenášeny dědičné faktory součástmi normálních buněk a to vedlo k obecnému závěru, že dědičné faktory buněk (nebo alespoň jednoduchých bakteriálních buněk) se skládají výhradně z nukleové kyseliny. Pokusy s virem tabákové mozaiky ukázaly, že RNA může stejně jako DNA být nositelkou dědičných znaků.

Z biochemického hlediska je tento pokus poněkud přehlednější než transformace. RNA získaná z viru tabákové mozaiky nepředstavuje směs zlomků nukleové kyseliny, ale všechny molekuly RNA mají stejnou délku a stejnou vnitřní strukturu. RNA viru TMV je jednoduchá řetězovitá molekula s asi 6000 nukleotidů. V tomto případě tedy lze použít zobecnění Beadle-Tatumova pravidla "jeden gen, jeden enzym" na pravidlo "jeden gen, jedna bílkovina". Bílkovinný materiál TMV nemá žádnou enzymovou aktivitu a slouží pouze jako ochrana RNA viru TMV proti vnějším vlivům. Vzhledem ke své biochemické přehlednosti sehrál virus TMV důležitou úlohu v dalším rozvoji molekulární genetiky.

V tomto stadiu výzkumu se usuzovalo, že DNA funguje jako dědičný materiál pro živé buňky a RNA pro viry. Byly však nalezeny viry, které obsahovaly DNA, například bakteriofágy typu T. U těchto fágů se DNA vyskytuje v hlavičkách, které mají tvar ručního granátu. To, že tato DNA představuje dědičný faktor, prokázal Američan Hershey několik let předtím, než byly provedeny pokusy s TMV.

Ve srovnání s TMV jsou T-fágy vystavěny značně složitěji. Mají šestibokou hlavicovou část, v jejímž bílkovinném obalu je hustě směstnána DNA a bičík, který se skládá ze dvou do sebe vsunutých válečků. Na konec bičíku nasedá šest vláknitých výběžků jako nohy komára, tak se jeví bičík při smrštění. Tento složitý aparát je složen z různých druhů bílkovinných molekul, kdežto bílkovinný obal TMV je složen z jediného druhu bílkoviny. Hershey studoval, která část fágů T2 je podstatná pro vznik potomků v napadené buňce, zda jsou to bílkoviny nebo DNA. Badatelům se podařilo fyzikálními metodami vyjmout DNA z bílkovinného obalu fágů. Prázdný bílkovinný obal přilnul pevně na hostitelské buňky stejně, jako celý fág, ale nové fágy nevznikaly. Bílkovinný obal fágů slouží tedy k připojení k hostitelské buňce, ale o dalších pochodech při množení fágů nebylo možné říci nic, protože se pracovalo s mechanicky poškozenými součástmi fágů. Hershey použil při svém pokusu metodu radioaktivního značení. Vyšel z úvahy, že součást, která je podstatná při produkci potomstva fágů, musí vniknout no nitra buňky hostitele a tam převést metabolismus na produkci nových virových částic. Sestavil pokus tak, aby se v paralelních kulturách infikovaných buněk zabudovala radioaktivně značená síra a fosfor do nově vznikajících fágových částic. Síra se zabuduje pouze do bílkovinného obalu, fosfor pouze do nukleové kyseliny.

Tímto způsobem Hershey sledoval osud bílkoviny a nukleové kyseliny, přestože byly současně přítomny ve velkém zbytku jiné látky. Vyřešit tuto úlohu biochemickými metodami je beznadějné. Hershey přidal vyčištěné, radioaktivně značené fágy ke zdravým bakteriím. Ponechal několik minut času, aby virové částice přilnuly k buňkám baktérií a pak směs krátce zhomogenizoval v mixéru při vysokých otáčkách. Bakteriální buňky zůstaly intaktní, kdežto vše, co lpělo na vnější straně bakteriálních buněk a neproniklo dovnitř, bylo rozrušeno. Potom odstředil bakteriální buňky a v sedimentu i supernatantu stanovil množství radioaktivní síry a fosforu. Ukázalo se, že do buněk hostitele vnikla celá nukleová kyselina a pouze malá část bílkoviny, kdežto největší část bílkoviny byla nalezena v supernatantu a zřejmě tedy ulpěla na bakteriálních buňkách zvnějšku. Na bakteriálních koloniích se vytvořily plaky a Hershey tím prokázal, že se jeho metodou nepoškodil infekční proces. Zřejmě byla virová bílkovina již zbytečná, jakmile se fágy zachytily na povrchu bakteriální buňky. Nukleová kyselina pronikla do nitra buňky hostitele a tam uvedla do chodu proces vytváření nových fágů. Hersheyho pokus měl drobnou chybu, protože do buněk hostitele vniklo i několik procent fágových bílkovin. Všechny další pokusy na bakteriofázích však potvrdily, že Hersheyho závěry o funkci nukleových kyselin jsou správné.

Myšlenka genu a dědičné informace vznikla při pokusech na vyšších organismech. Chemická podstata dědičnosti byla vyřešena u bakterií a virů. Zda nukleová kyselina je nositelem dědičnosti u vyšších organismů je dnes prokázáno řadou nepřímých důkazů. Dodnes nebyl nalezen organismus, jehož buňky by neobsahovaly DNA. Chromosomy, které jsou nositeli genů, obsahují vždy DNA a kromě toho také určité množství bílkovin. Obsah DNA v jádrech všech buněk určitého organismu je téměř vždy stejný. Pohlavní buňky obsahují o polovinu méně dědičného materiálu než ostatní buňky organismu. Tato skutečnost dobře koreluje s pozorováním, že pohlavní buňky obsahují jen jednu sadu dědičných faktorů, ostatní buňky obsahují sadu dvojitou. Spermie jsou specializované buňky, jejichž jediným účelem je doprava DNA do vaječné buňky. Pokud jsou všechny dědičné vlastnosti zakotveny ve struktuře molekul nukleových kyselin, měly by složitější organismy obsahovat více nukleové kyseliny než organismy jednodušší. Tato skutečnost se potvrdila, jak ukazuje následujícící tabulka.

Jistě by bylo možné problém uzavřít průkazem transformace pomocí vyčištěných preparátů DNA u vyšších organismů. I tyto pokusy byly již provedeny. Byly provedeny pokusy na Drosophile, kdy přenášeným znakem pomocí DNA se týkal zabarvení povrchu těla. Zřejmě nedošlo ke transformaci celého organismu, ale pouze určitých malých skupin buněk. Rovněž jsou zprávy o transformaci u vyšších rostlin. U petunií se přenesla nukleovými kyselinami schopnost k tvorbě barviva květů. Všechny pokusy však dosud nebyly úspěšně opakovány v jiných laboratořích a nelze je tedy považovat za průkazné.

S poznáním, že určité řetězovité molekuly jsou nositelkami dědičných faktorů, se objevila otázka, jak je v těchto molekulách informace uložena, jaký je použitý kód.

Milostné hry jsou u zvířat sice poněkud zjevné, ale trvalo staletí, než byla pochopena jejich souvislost s rozmnožováním. Teprve po několika generacích vědců se prokázalo, že při sexuálním rozmnožování dochází ke spojování dědičné výbavy. Rostliny mají subtilnější milostný život než zvířata, a proto o něm až do konce 17.století existovaly jen dohady, až konečně botanik Camerarius z Tubingen prokázal kastračním způsobem, že tyčinky a pestíky jsou pohlavními orgány rostlin.

Z hlediska genetiky je sexuální spojení prostředkem, jak smísit otcovský a mateřský dědičný základ. Je možný velký počet nových kombinací, i když se rodiče odlišují jen v několika málo dědičných faktorech. Tím se zvyšují vyhlídky na přežití druhu, neboť při měnících se vnějších podmínkách se neustále ověřují dědičné kombinace nejzpůsobilejší k životu. Při nepohlavním rozmnožování nové kombinace vznikají pouze při mutacích. U rostlin se vedle pohlavního často objevuje i nepohlavní rozmnožování, které je u baktérií ve formě jednoduchého dělení buněk.

Po zjištění, že dědičné faktory buněčných organismů jsou umístěny na molekule DNA bylo možno sexuální děje definovat jako přenos DNA z dárce ("samečka") na příjemce ("samičku"). Tento přenos jsme poznali například u transformaci pneumokoků, při níž nukleová kyselina je přijata buňkou příjemce, která současně získá nové genetické vlastnosti. Nejstarší pokusy Griffitha s transformacemi, při kterých byly mrtvé buňky kmene dárce vpraveny do těla myši současně s živými buňkami kmene příjemce, napovídají, že taková transformace se může odehrát i "v přírodě". Probíhá však pravé párování také u baktérií?

Někteří vědci se domnívali, že něco podobného pozorovali pod mikroskopem, ale mohlo jít o náhodné spojení bakteriálních buněk. Z ojedinělých údajů byl učiněn závěr, že sexuální děje u baktérií jsou vzácné, pokud vůbec existují.

Američané Tatum a jeho aspirant Ledergerg, který se později stal nejslavnějším bakteriálním genetikem, uvažovali následovně: sexuální děje vedou k rekombinaci dědičných faktorů a proto lze výskyt rekombinant využít opačně, jako signálu sexuálních dějů, které nelze pozorovat přímo. Biochemické mutanty byly pro tento plán obzvláště výhodné. Divoký typ Escherichia coli má schopnost syntetizovat vitaminy biotin a B1 a aminokyseliny fenylalanin, cystein, threonin a leucin (viz přílohy 9 a 2). Tuto dědičnou schopnost lze schématicky vyjádřit:

divoký typ:                 biotin+  fenylalanin+  cystein+  threonin+  leucin+  B1+

Znaménko "+" označuje schopnost syntetizovat příslušnou látku, kdežto mutanty, které mají defektní schopnost syntetizovat určitou látku, jsou označeny znaménkem "-". Jako divoký typ označujeme výchozí kmen, u něhož nejsou přítomny defektní mutace.

Lederberg a Tatum ozařovali kultury E.coli ultrafialovým zářením. Opakovaným vyvoláváním mutací a výběrem požadovaných mutant získali následující typy:

mutanta 1:                   biotin-   fenylalanin-   cystein-   threonin+   leucin+   B1+

mutanta 2:                   biotin+   fenylalanin+  cystein+  threonin-   leucin-    B1-

Na minimálním živném médiu, obsahujícím pouze soli a jeden typ sacharidu jako zdroje uhlíkatých látek, nemohla růst ani jedna z uvedených mutant. Nebyly pozorovány ani jinak běžné zpětné mutace k růstu divokého typu, neboť bylo velmi málo pravděpodobné, že se náhodně získají tři různé biosyntetické schopnosti v jedné buňce. Vědci tedy začlenili do svých pokusů více defektů, aby mohli pozorovat vzácné rekombinační události nerušené náhodnými zpětnými mutacemi. Lederberg a Tatum smísili kultury mutanty 1 a mutanty 2 a vyseli směs na minimální živnou půdu. Výchozí typy sami o sobě na ní nemohly růst a proto vědci vyseli na jednu Petriho misku až sto miliónů buněk. Následující den se objevilo asi sto kolonií Escherichia coli na plotnách, na nichž byla vyseta směs mutant, nikoliv však na kontrolních plotnách, na kterých byly vysety mutanty odděleně. Došlo tedy skutečně k rekombinaci a to průměrně k jedné mezi miliónem rodičovských buněk.

Lederberg a Tatum také prokázali, že rekombinace nenastane, pokud je jedna z mutant usmrcena nebo když se smísí filtrát kultury jedné mutanty s živými buňkami druhé. Muselo tedy dojít k fyzickému kontaktu živých buněk, aby se dědičné faktory přenesly.

Genetická rekombinace E.coli byla záhy nato potvrzena v dalších laboratořích. Další výzkum sexuality tohoto primitivního organismu ukázal, že lze rozlišit tři pohlaví: "samičí" (označeny F-), "samčí" (F+) a "supersamčí" (Hfr), kde F označuje plodnost (fertilitu). Kmeny F- netvoří vzájemně páry a nedochází tedy k rekombinacím. Homosexuální párování mezi kmeny F+ však vede k rekombinacím, ikdyž s nižší frekvencí než heterosexuální párování kmenů F+ a F-. Supersamčí kmeny byly objeveny později. Tyto kmeny rekombinují s vysokou frekvencí (Hfr - High frequency of recombination)

Buňka Escherichia coli má střed buněčného prostoru vyplněn klubíčkem DNA. Opatrným rozpouštěním buněčné stěny lze získat nepoškozenou DNA a zpracovat ji pro pozorování elektronovým mikroskopem. V elektronovém mikroskopu se tato DNA jeví jako jediná molekula ve tvaru kruhu. Tento primitivní chromosom představuje životně důležitý soubor genů - genom. U kmenů F+ existuje v buňce další chromosom - episom, nositel F-faktoru. Jde o malou molekulu DNA ve tvaru kruhu, která je nezávislá na genomu. Episom lze považovat za pohlavní chromosom a je přítomen v samčích buňkách. Není životně důležitý, protože buňky kmene F- žijí bez něj. Episom nese dědičnou informaci, která řídí tvorbu nepatrných pohlavních orgánů na povrchu samčích buněk. Jsou to rourky z bílkovinných molekul, jimiž DNA zřejmě prostupuje při konjugaci do samičích buněk. Samčí buňky E.coli mohou "pohlavně onemocnět". Na bílkovinné rourky se napojí určitý typ kulovitých bakteriofágů, které zřejmě vstříknou do oběti vlastní nukleovou kyselinu. Tyto fágy napadají pouze samčí buňky E.coli a proto bylo možno podle jejich napojení zřetelně odlišit v elektronovém mikroskopu pohlavní organely od jiných výběžků na buněčném povrchu. Tato morfologická vlastnost však není přímou příčinou toho, proč označujeme kmeny F+ a Hfr jako "samčí" a kmen F- jako samičí. Označení spočívá spíše na následujícím pokuse: zvolíme pro konjugaci dva kmeny E.coli, z nichž jeden je citlivý na antibiotikum streptomycin, kdežto druhý je rezistentní. Když se spárují, usmrtíme jednoho z partnerů streptomycinem. Potomstvo s rekombinovanými dědičnými faktory získáme pouze tehdy, jestliže byl vůči streptomycinu rezistentní kmen F-. Z toho plyne, že DNA byla přenesena z kmene Hfr nebo F+ na kmen F-. Tak jako v mnoha případech v biologii nemusí samčí partner po sexuálním spojení dále žít, kdežto samičí partner musí nutně přežít pro vznik potomstva.

Za přenos genomu odpovídá F-faktor samčího partnera, episom. U kmene F+ splyne s DNA genomu, rozštěpí kruh a může vsunout rozvinutý chromosom do samičí buňky. Tento jev je vzácný. Mnohem častěji F-faktor pronikne volně do samičí buňky. Buňka příjemce nezíská tímto způsobem nějaké nové alely životně důležitých dědičných faktorů, ale sama se stane "samčí". "Super-samčí" kmeny mají v genomu trvale zabudovaný F-faktor. Z tohoto důvodu jsou velmi aktivní při přenosu dědičných faktorů z genomu, nikoliv však při předávání vlastního pohlaví, což buňky F+ uskutečňují přenosem volného F-faktoru.

Při pohlavním rozmnožování má genetik možnost zjistit něco o uspořádání dědičných faktorů v genomu. Na příkladu Drosophily jsme viděli, jak statistický výzkum frekvence, s jakou jsou vyměňovány dědičné faktory, může vést k sestavení "genové mapy". Pracovní skupina Pasteurova ústavu v Paříži vymyslela zcela novou mapovací metodu pro E.coli, která spočívala na zcela zvláštním konjugačním mechanismu mezi buňkami Hfr a F-. Pokud je při konjugaci dvou buněk E.coli molekula DNA samčí buňky vsunována do samičí buňky, měly by se tam jednotlivé dědičné faktory dostat jeden po druhém. Na tomto předpokladu spočívala metoda "přerušované konjugace", pomocí níž byla sestavena genová mapa E.coli. Kmeny E.coli byly zvoleny tak, že samičí buňky nesly výhradně defektní mutanty, zatímco samčí buňky měly příslušné dědičné faktory divokého typu. Byly smíšeny samčí a samičí buňky, došlo ke konjugaci a vlákno DNA začalo přestupovat ze samčí do samičí buňky. V přesných intervalech, za 5, 10, 15 a 20 minut byly z bakteriální suspenze odebírány vzorky, které byly prudce roztřepány v mixéru, aby se zabránilo pokračování konjugace. Vzorky z různých intervalů pak byly naočkovány na sadu živných půd. Použily se samčí buňky citlivé na streptomycin, které byly tímto antibiotikem usmrceny. Tímto způsobem bylo možné zjistit, které biochemické vlastnosti původně defektních samičích buněk byly získány konjugací. Vyhodnocení získaných dat ukázalo, že dědičné faktory pro určité vlastnosti vstupovaly do samičích buněk vždy v určitém časovém intervalu po konjugaci. Bylo např. zjištěno, že faktor pro syntézu threoninu se přenesl za 8 minut po začátku konjugace, faktor pro syntézu leucinu se přenesl za 8 minut a 30 sekund, faktor pro zkvašování laktosy za 18 minut, faktor pro zkvašování galaktosy za 24 minut.

V tomto sledu musí být tudíž dědičné faktory uspořádány na chromosomu. Jestliže kromě toho platí, že vlákno DNA buňky Hfr se posunuje do buňky F- konstantní rychlostí, musí experimentálně nalezené časové úseky odpovídat prostorovým odstupům dědičných faktorů na chromosomu. Velkým počtem různých křížení se dospělo posléze k celkové genové mapě ve tvaru kruhu, což odpovídá mikroskopickému pozorování DNA. Při procesu konjugace se tento kruh DNA rozštěpí.

J. Lederberg chtěl později rozšířit své nálezy také na baktérie Salmonelly, vyvolávající tyfus. V laboratoři se používá kmen Salmonelly, která vyvolává tyfus u myší. Se svým aspirantem Zinderem začal podobné rekombinační pokusy s biochemickými mutantami, které předtím úspěšně provedl u E.coli. Tito vědci skutečně získali hledané rekombinanty. Aby prokázali, že nalezené rekombinanty skutečně pocházejí z konjugace mezi výchozími kmeny, provedli následující pokus: použité kmeny baktérií umístili odděleně v ramenech trubice tvaru U, která ve středu byla rozdělena pórovitým skleněným filtrem, kterým baktérie neprocházejí. Samčí a samičí buňky se tak nemohly setkat, ale byly umístěny ve společném roztoku živného média. Lederberg a Zinder s překvapením konstatovali, že i přesto vzniklo potomstvo s rekombinovanými faktory.

Nemohlo jít o transformaci účinkem volné DNA, protože enzym desoxyribonukleasa nezabránil přenosu dědičných faktorů. Ukázalo se, že přenos v kulturách Salmonelly zajistil fág. Použité baktérie byly "lysogenní" pro tyto fágy, což znamená, že jejich buňky obsahovaly fágovou DNA zabudovanou do svého chromosomu. Příležitostně se však fág opět osamostatnil a vytvořil potomstvo v některých buňkách, které v důsledku toho uhynuly. Takové virové částice mohly přirozeně pronikat skleněným filtrem z jednoho ramena trubice do druhého, kde byly rodičovské baktérie. Oba vědci pojali podezření, že fágové částice transportovaly dědičný materiál mezi kmeny Salmonelly. Po vyčištění fágů tato domněnka byla potvrzena.

Později bylo nalezeno vysvětlení pro tento zvláštní transport dědičného materiálu. Ukázalo se, že v kultivační tekutině byly fágy dvojího druhu. Většina z nich mohla infikovat baktérie a stvořit fágové potomstvo, avšak nemohla přenést dědičné faktory hostitele. Několik málo fágů přenášelo geny hostitele, avšak nemohlo vytvořit potomstvo. Zřejmě při uvolnění fágové DNA z hostitelské DNA došlo k náhodné chybě, čímž byla přenesena také část DNA hostitele a místo toho zůstala stejná část fágové DNA v hostitelské buňce, protože do hlavičky fágu se vejde jen určité množství DNA. Protože pro reprodukci fágů jsou nutné všechny fágové geny, byly tyto fágy sterilní, tedy do určité míry fungovaly jako spermie pro organismy hostitelů. Tento jev se nazývá transdukce.

Poznali jsme tedy tři různé mechanismy, jimiž se mohou přenést dědičné faktory z jedné baktérie na druhou. Při konjugaci je nutný kontakt živých buněk. Při transdukci funguje bakteriální virus jako přenašeč dědičného materiálu z buňky na buňku. Při transformaci se přenáší pouze molekula DNA.

Ve všech uvedených případech se přenesená DNA dárce stane jen tehdy trvalou součástí dědičné výbavy příjemce, jestliže se zabuduje do jeho DNA. K tomu může ale také nemusí dojít. Proto je počet rekombinant u baktérií poměrně malý. Baktérie obsahují vlastní enzym pro zabudování úseků DNA. U tohoto enzymu může dojít mutací k defektu a pak samičí baktérie nemohou vyměňovat své geny s ostatními baktériemi.

Povšimněme si ještě procesu "lysogenie" prostřednictvím fágů. Při tomto procesu fág infikuje baktérii, ale nechová se jako parazit, nýbrž jako symbiont. Jeho DNA se zabuduje do chromosomu baktérie a množí se spolu s bakteriální DNA, čímž se dědičně přenáší na další generace.

Bakteriální buňky s úsekem fágové DNA ve svém chromosomu se nijak neliší od ostatních bakteriálních buněk. Rozdíly jsou pozorovatelné pouze tehdy, když se fágová DNA aktivuje, vytvoří nové virové částice a usmrtí hostitelskou buňku. Existují však defektní mutanty fágů, které natrvalo ztratily schopnost se aktivovat. Schopnost baktérií záškrtu vyvolat infekci tkví v tvorbě difterického toxinu. Dědičný faktor pro tuto schopnost však nezávisí na DNA baktérie, nýbrž na DNA fágu. Jenom tehdy, když baktérie záškrtu obsahují tuto fágovou DNA, tj. jsou lysogenní, produkují toxin a vyvolávají infekci. Příčinou nejznámější vlastnosti Corynebacteria diphteriae je tedy fág. Při popisu konjugace u baktérií jsme uvedli, že existuje určitý typ pohlavního chromosomu, který umožňuje přenášení znaku samčí buňky, který se šíří podobně jako infekce. Takový chromosom se označuje episom.

Donedávna episomy zajímali jen úzký okruh bakteriálních genetiků. V posledních letech však vyvolaly obavy u lékařů. Na japonských klinikách se při vypuknutí dysenterie zjistilo, že některé kmeny se staly rezidentní vůči celému spektru léčebných prostředků, takže lékaři byli dlouhou dobu bezmocní. Již dlouhou dobu bylo známo, že baktérie se mohou stát rezidentními k antibiotikům, jako např. penicilinu nebo streptomycinu. S takovým obvyklým typem si lékaři však uměli snadno poradit, protože mutanta získala rezistenci jen vůči jednomu typu antibiotik a bylo možno baktérie usmrtit postupným nárazovým podáním různých antibiotik. Hospitalizace pacienta v sobě může nést riziko pro vznik rezistence běžného typu. V nedostatečně udržovaných místnostech klinik se odehrává pozvolná evoluce, při níž kmeny baktérií, které tam přežívají, přejímají rezistenci od druhých. Zpráva z Japonska byla daleko závažnější. Bylo pozorováno, že celé bakteriální populace se rázem staly rezistentními k antibiotikům chloramfenikolu, streptomycinu, tetracyklinům a syntetickým sulfonamidům. Tuto skutečnost nebylo možno vysvětlit běžnými náhodnými mutacemi. Záhada by čekala dlouho na rozřešení, kdyby základní výzkum nepřinesl výsledky přípravného studia. Podařilo se tak zjistit, že příčinou je episom, který mohl být infekčně přenášen, a obsahoval celou řadu dědičných faktorů způsobujících různé rezistence. Dodnes není jasné, jak mohlo dojít ke vzniku takového komplexního episomu. Vznik rezistentních faktorů nelze předvídat, zejména tehdy, když mohou být přenášeny z jednoho bakteriálního kmene na jiný. Byl například pozorován přenos faktoru z neškodných baktérií E.coli na Salmonellu, což pacienty s tyfem uvedlo do beznadějné situace.

Jaká je situace u virů? Existuje přenos dědičných faktorů z viru na virus? U T-fágů napadajících E.coli se často vyskytují mutanty, které vyvolávají na bakteriálních koloniích poněkud jiný vzhled plakům než divoký typ. Mohou např. být plaky větší než u normálního typu nebo nejasné. Naočkujeme baktérie E.coli směsí T-fágů, z nichž jeden způsobuje velké nejasné a druhý malé jasné plaky. Vzniknou čtyři typy plaků. Rodičovské typy jsou velké- nejasné a malé-jasné, rekombinantní typy jsou malé-nejasné a velké-jasné. Muselo tedy dojít k události podobné křížení. Tento základní pokus bakteriofágní genetiky nejprve provedl v roce 1943 van Delbruck a Baley ve stejném roce, kdy Lederberg a Tatum objevili sexualitu příslušného hostitelského organismu E.coli.

Křížení fágů bylo možné provést se třemi rodičovskými typy, které mají různé alely pro znakové páry A/a, B/b a C/c. Křížením tří různých rodičovských typů vznikly rekombinanty:

Abc x aBc x abC ----> ABC

Protože rekombinanta měla znaky všech tří rodičovských typů, muselo dojít v infikované bakteriální buňce k určitému druhu skupinového sexuálního spojení mezi rodičovskými fágy. Doposud však nebyla pozorována rekombinace u RNA-bakteriofágů, ačkoliv jsou tyto fágy dobře prostudovány.

Určité rostlinné RNA-viry používají obdoby rekombinace. Virové částice mají stejný bílkovinný obal, ale obsahují různé části genomu ve formě nestejných úseků DNA, z nichž pouze jeden nese dědičný faktor pro obalovou bílkovinu. V hostitelské buňce se může uplatnit kterýkoliv z dědičných faktorů. Pokud se setkají dva takové "mnohosložkové" viry, dojde k rekombinaci těchto dědičných faktorů.

Seznámili jsme se s tím, jak primitivní organizační stupně života, baktérie a viry realizují sexuální děje, které slouží k přenosu dědičných faktorů. Víme již, že hmotným základem dědičných faktorů jsou nukleové kyseliny.

                                                                                         - pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci