Pokud se hovoří o budoucích aplikacích molekulární biologie, často se objevují pojmy jako "umělý život", "cílené zlepšení genetického materiálu" nebo "přenos inteligence". Lze v tomto směru skutečně něco od molekulární biologie očekávat, v něco doufat nebo něčeho se obávat?

Manipulace s dědičnými faktory nebo produkty genů je jen jedna z mnoha možných aplikací molekulární biologie. Po vyřešení genetického kódu, který byl centrálním problémem tohoto oboru, byly nalezeny nové směry výzkumu.

Do jaké míry se podařilo biologicky důležité makromolekuly napodobit a vytvořit? Lze do kódu v nukleových kyselinách vložit informace, které jsme si sami zvolili? Lze konstruovat bílkoviny a lze tyto umělé produkty vložit do organismu a ovlivnit tím životní pochody?

V roce 1970 byla provedena první syntéza genu "in vitro" (ve zkumavce), tedy úseku DNA s určitým sledem bází "dávající smysl" a byl syntetizován první enzym. Tuto syntézu uskutečnil Američan Merrifield a jeho pracovní skupina. Jeho metoda se odlišovala od jiných syntéz biologických makromolekul tím, že pracoval výhradně s prostředky preparativní organické chemie. Nepotřeboval žádné extrakty nebo součásti živých buněk. Merrifieldova metoda byla založena na postupném napojování aminokyselin na rostoucí řetězec a syntéza byla řízena počítačem. Karboxylový konec řetězce se napojoval na granule umělé pryskyřice a nové členy řetězce se připojovaly na aminovém konci. Jakmile byl řetězec sestaven, chemickou reakcí se uvolnil od granulí pryskyřice a mohl se prostorově stočit. Merrifield připravil touto metodou enzym ribonukleasu. Tento enzym obsahuje 124 aminokyselin a je často biochemiky používán. Normálně se získává z pankreasu (slinivky břišní) jatečního dobytka. Následující tabulka porovnává pracovní postup a výkonnost žlázových buněk a Merrifieldovy skupiny.

Je vidět, že umělá metoda zatím nemohla konkurovat rychlostí syntézy. Přirozený zdroj však dodává enzym ve směsi s mnoha jinými bílkovinami, od nichž musí být zdlouhavě čištěn. Slinivka břišní jatečního dobytka je odpadním produktem a proto umělá metoda zatím nemůže přírodní metodu nahradit. Plánovitá syntéza bílkoviny však prokázala jednoznačně, že strukturální vzorec získaný analýzami je správný. Při umělé syntéze máme volnost jednání a lze do řetězce bílkoviny zabudovat jiné aminokyseliny a tuto záměnu lze provést cíleně.

Jaké jsou vyhlídky na umělé geny a na možnost manipulace s dědičným základem? Tato otázka se obrací na výzkum a syntézu nukleových kyselin. První biologicky aktivní nukleová kyselina připravená "in vitro" byla RNA fágu Qbeta, obsahující asi 4500 členů řetězce. Tuto syntézu provedl Američan Spiegelman. Nešlo o čistou chemickou syntézu, protože dvě složky syntézy byly získány z živých buněk: virem indukovaný enzym replikasa z bakteriálních buněk infikovaných fágem Qbeta a RNA z fágových buněk Qbeta. Později se Spiegelmanovi podařila bezbuněčná syntéza aktivní replikasy Qbeta z RNA fágu Qbeta a extraktu z buněk E.coli. Matrice nukleové kyseliny předala informaci o sledu bází v průběhu párování bází a badatel nemusel tento sled vůbec znát. Spiegelman svým pokusem prokázal, že RNA vytvořená "in vitro" je stejně dobrou matricí pro další syntézu RNA jako původní přírodní RNA. Ačkoliv neznáme sled bází, pokus prokázal, že syntéza ve zkumavce postupuje prakticky bez chyb od báze k bázi. Spiegelman se pokoušel vynutit evoluční vývoj tím, že postupně zkracoval reakční dobu a získával kratší molekuly RNA, které se stále častěji odchylovaly od původní RNA. Takto zkrácené úseky RNA byly syntetizovány podstatně rychleji, ale pochopitelně neměly žádnou aktivitu v bakteriálních buňkách, neboť se ztratila podstatná část informace.

První DNA-virus, jehož nukleová kyselina byla připravena synteticky, byl bakteriofág Phi X 174. Také k syntéze této DNA bylo zapotřebí enzymů z živých bakteriálních buněk a nukleové kyseliny fágu jako matrice.

Při manipulaci s dědičným materiálem byly ovšem celulární dědičné faktory zajímavější než virové nukleové kyseliny. Začátkem roku 1972 byla v několika amerických pracovních skupinách uskutečněna syntéza dědičných faktorů z vyšších buněk. Dědičné faktory, tedy úseky DNA, jsou uloženy v naprosto nepřehledné směsi s desetitisíci jiných dědičných faktorů. Metoda syntézy byla založena na použití odpovídající informační RNA. Červené krvinky mají proteosyntézu zaměřenou výhradně na tvorbu alfa a beta řetězců hemoglobinu. Proto se podařilo připravit odpovídající RNA v téměř čistém stavu. Donedávna však ještě nebylo možné přejít od informační RNA k odpovídajícímu úseku DNA. S objevem "opačně kopírujícího enzymu" v nádorových RNA virech se situace podstatně změnila. Ve třech pracovních skupinách použili informační RNA pro globiny jako matrice pro uvedený enzym, reverzní transkriptasu. Výsledkem byl první úsek genu připravený ve zkumavce, a to genu vyššího organismu, v jednom případě genu člověka.

Když jsme hovořili o výměně dědičného materiálu mezi buňkami, seznámili jsme se s transdukcí. Jako transdukci označujeme přenos dědičných faktorů z buňky dárce na buňku příjemce prostřednictvím určitých fágů. Takové transdukující viry jsou vhodný materiál pro genetické manipulace. Podařila se reprodukce genu pro enzym beta-galaktosidasu baktérie E.coli zabudováním tohoto genu do bakteriofágů. V říjnu 1971 bylo referováno o modelovém využití této techniky v humánní medicíně. Galaktosemie je recesivní nemoc u člověka, která se projevuje přítomností cukru galaktosy v krvi a která vede k těžkým fyziologickým poruchám. Galaktosemie je způsobena tím, že postižení jedinci (kteří jsou homozygoti vzhledem ke genu pro galaktosemii) chybí enzym pro odbourávání galaktosy (viz příloha 3). Vzniká tím problém pro baktérie E.coli ve střevech lidí, jak odbourávat galaktosu. Jestliže baktérii nabídneme laktosu, tvoří enzym beta-galaktosidasu, která rozkládá laktosu na glukosu a galaktosu. Galaktosa musí být včleněna do normálního metabolismu glukosy, pokud má být využita jako živná látka. Baktérie E.coli proto vytváří enzym, který provádí stejný stupeň štěpení galaktosy, který probíhá i u geneticky zdravých lidí. Podařilo se připravit defektní kmen fágů lambda, u něhož byla část fágové DNA nahrazena bakteriálním genem pro štěpení galaktosy. Tyto fágy lze připravit v čistém stavu a extrahovat z nich DNA. Získáme tak dostatečně obohacený preparát žádaného genu. Od pacientů s galaktosemií byly získány buňky pojivových tkání a pěstovány v tkáňové kultuře. Na rozdíl od buněk zdravých lidí nebyly schopné odbourávat galaktosu. Tyto buňky byly infikovány buď kompletními částicemi fágu lambda popsaného typu nebo kyselinou DNA, která z nich byla extrahována. Buňky, na které se takto působilo, získaly částečně schopnost odbourávat galaktosu a tuto schopnost předávaly dceřinným buňkám. Odstranil se tak jejich genetický defekt. Baktérie E.coli poskytla přes virus genovou proteasu pro lidské buňky.

Je otevřen věk genetických manipulací u člověka? Pacient nemá prospěch z toho, že buňky získané z jeho tkáně úspěšně rostou, zatímco on zůstává nemocný. Injekce DNA nemá význam, protože obnažená molekula DNA by byla rychle odbourána DNAasami přítomnými v tělních tekutinách a fágy by vyvolaly nežádoucí imunitní reakci. Jedinou možností je zpětná implantace geneticky uzdravených buněk do těla. Tomu nestojí nic v cestě, alespoň u některých typů tkání, protože buňky původně tělu vlastní nebudou zničeny imunitním systémem. Otázkou je, zda lze do organismu vpravit dostatečný počet uzdravených buněk. Je možné, že tyto buňky budou mít ve srovnání s defektními lepší schopnosti růstu a tak nakonec nabudou v těle převahu.

Tím jsme se dostali do oblasti spekulací. U žádného člověka zatím nebyl dědičný defekt zhojen, ať již přímo nebo nepřímo, použitím preparátu nukleové kyseliny. Pouze u poměrně malého počtu tkáňových typů lze buňky z tkáně vyjmout, pěstovat na tkáňové kultuře a vložit zpět do tkáně. Aby implantace genu byla úspěšná, musí být genetický defekt přesně znám a "náhradní gen" se musí získat v dostatečném množství. Tyto podmínky jsou splněny jen u poměrně jednoduchých enzymových defektů. Uvedeným způsobem nemohou být odstraněny geneticky podmíněné poruchy vývoje, které jsou způsobeny nějakou nedostatečností při regulaci růstu embrya. Pokud by se podařilo zhojit dědičnou nemoc dosazením "náhradního" genu, pomohlo by se tím jen nemocnému jedinci, nikoliv jeho potomkům.

Dnes je již možno syntetizovat řetězové molekuly nukleových kyselin a bílkovin s libovolně zvoleným sledem stavebních prvků. Manipulace s dědičným základem jen velmi pomalu nalezne cestu do medicíny a je možné, že genetické manipulace nebudou proveditelné vůbec.

Kam směřuje základní výzkum molekulární biologie? Do popředí vystupují zejména dvě odvětví:

1. Diferenciace buněk a orgánů vyšších organismů

2. Funkce centrálního nervového systému

První téma bylo již několikrát zmíněno. Jedním z hlavních problémů je mechanismus, jakým dochází k plánovitému zapnutí a vypnutí dědičných faktorů. Buňky pojivových tkání, svalů, žláz, nervů a krve mají všechny stejný genový základ. V důsledku dlouhodobých regulačních mechanismů však zajišťují nejrůznější biochemické aktivity. Tyto regulační mechanismy jsou stabilní natolik, že jednou přijatý stav přetrvává v tkáňové kultuře po mnoho generací. Tímto způsobem mohou žít déle, než původní organismus.

Druhé téma je naproti tomu odvětví, kde lze prokázat naprostou nedostatečnost všech biologických výzkumných směrů, které v současnosti existují.

Jak a kde je informace v mozku uložena a jak je v případě potřeby vyvolána? Když se ukázalo, jak nesmírný potenciál k uložení informace na nepatrném prostoru mají biologické řetězové molekuly, přijali někteří badatelé myšlenku, že takový mechanismus je účinný nejen při dědičnosti, ale také při fixaci paměťové informace. Předpokládalo se, že jde o ribonukleové kyseliny nebo polypeptidické řetězce. V prvním případě by informace byla uložena ve sledu bází, ve druhém ve sledu aminokyselin. Jaké jsou dnešní doklady pro existenci paměťových molekul?

Biologickou stránkou pokusů je obvykle proces učení a následný test toho, jak se bude pokusné zvíře chovat. Ojediněle byli použity k těmto pokusům někteří červi, kteří žijí ve vodě a mají difúzní nervový systém. Většinou se pokusy prováděly na obratlovcích, jako na rybách, krysách nebo myších. Biochemická stránka spočívá v analýze makromolekul, které jsou syntetizovány. První, kdo začal rozsáhlé pokusy tohoto druhu byl švédský biochemik Hydén. Zjistil, že při procesu učení stoupala v nervových buňkách syntéza RNA a bílkovin a že nově vytvořená RNA měla jiný sled bází, než původně přítomná RNA. Když byl zlatým rybkám vpraven do mozku puromycin, který inhibuje proteosyntézu, byl proces učení přerušen. Poněkud ukvapeně byl vysloven názor, že informace je ukládána v polypeptidických řetězcích. Ve skutečnosti tyto pokusy pouze prokázaly, že tvorba makromolekul je nezbytná pro funkci mozku a že stoupá při zvýšených nárocích. Nedokazuje nic o tom, kde je informace uložena. Byly podniknuty velmi rafinované pokusy, aby se prokázalo, že informace je uložena ve struktuře makromolekul. Pokusy probíhaly v zásadě tak, že zvířata byla určitým způsobem učena a pak z jejich mozku (nebo celého zvířete) byl připraven extrakt a ten byl přenesen neučeným zvířatům. U těchto příjemců bylo stanoveno, zda se tímto způsobem přenesl efekt učení.

Úspěšné pokusy tohoto typu byly nejdříve hlášeny u plochých červů, později také u myší a krys. Byla prokázána látková povaha alespoň některých paměťových obsahů a snad také molekulární kódování.

V tomto směru nejdále pokročily pokusy Američana Ungara na krysách. Pokud dáme krysu do klece, vyhledává obvykle nejtmavší místo. Ungar však v tmavé části klece dával krysám opakované elektrické šoky a tím je naučil, aby se vyhýbaly temnotě. Uvádí, že z mozku krys izoloval látku, která po vpravení do mozku neučených krys vyvolala stejné chování jako u krys učených: krysy se vyhýbaly temnotě. Látka byla získána v malém množství v čistém stavu a chemicky analyzována. Bylo stanoveno, že jde o polypeptid s 15 aminokyselinami a určený sled bází byl potvrzen chemickou syntézou. Látka dostala název "scotophobin" (viz příloha 2).

Jde o paměťovou molekulu? Již při patnácti členech řetězce je celkem 20^15, tj. asi 10^20 možností, jak 20 různých aminokyselin umístit na 15 různých míst. V jediné třídě takových molekul by bylo možno uložit všechny informace týkající se organismu a hromadící se zkušenostmi. Je však značně předčasné mluvit o paměťové molekule. Chybí důkaz, že sled stavebních částí skutečně odráží specifickou zkušenost z učení a proti hovoří některé zásadní skutečnosti: jak je možné, že se informace vybavuje tak rychle a jak je možné, že při poškození určité části mozku nedochází ke úplné ztrátě informace.

Poznatky o celulární výstavbě mozku jsou známy již několik desítek let. Ukazují, že tento orgán se specializoval k tvorbě nesmírného množství buněčných spojů. Nervové buňky vysílají mnoho velmi jemně rozvětvených výběžků, které navazují spojení s jinými nervovými buňkami. U člověka probíhá tvorba těchto spojů velmi rychle ještě během prvních let života. Tento typ spojů poskytuje prakticky neomezené množství variací, kterých může být použito k udržování informace. Tradiční teorie mozkové funkce spočívají na této myšlence. Překódování elektrických signálů ze smyslových orgánů mohou tradiční teorie vysvětlit lépe než molekulárně biologické teorie, podle kterých by se kódování mělo uskutečňovat tvorbou určitých makromolekul uvnitř buněk, nikoliv jen spojováním buněk.

Molekulární biologie by však mohla přispět i tehdy, kdyby se model buněčného spojování ukázal s konečnou platností jako správný. Zůstává totiž otázka, podle jakých vlastností nervové buňky navazují spojení jen s určitými buňkami, nikoliv s libovolnými. Biochemie rozpoznávání buněk podle povrchových struktur, která je v počátcích, by mohla případně vysvětlit tuto otázku.

Budoucí vyhlídky molekulární biologie nejsou omezeny pouze na technologické využití a další rozvoj jako základní vědy. Analytické myšlení, intuice a odvaha k nekonvenčním řešením otevřela cestu do krystalického uspořádání v subcelulární oblasti. Můžeme v zásadě porozumět funkci krystalů, ať už jsou nositeli informace nebo submikroskopickými stroji. Nemusíme hledat nové zákony, které by ležely mimo současnou fyziku. Procesy, které zpočátku vyhlížely záhadně, jsou vysvětlitelné pomocí znalostí současné fyziky. Připomíná nám to objev zákonů nebeské mechaniky, kdy stejnými zákony se řídí jak pád kamene na povrch Země, tak pohyb planet kolem Slunce. Galilei, Kepler a Newton tím tehdy zahájili věk vědy, věk vysoké myšlenkové produktivity v Evropě.

Dr. Harald Jockusch, nar. 1939, studoval ve Frankfurtu, v Tubingen a v Mnichově, postgraduálně v USA na univerzitě ve Wisconsinu. Vědecky pracoval v Institutu Maxe Plancka pro biologii v Tubingen a od r.1975 přednášel na univerzitě v Basileji.

Literatura:

[1] Jockusch, Harald: Kód života. Orbis, Praha 1977

[2] Blína, Jaroslav a kol.: Malá encyklopedie chemie. SNTL, Praha 1976

[3] Nomenklatura organické chemie. nakladatelství ČSAV, Praha 1974

[4] Ivanov, V.T. - Šamin, A.N.: Cesta k syntéze bílkovin. SNTL, Praha 1988

                                                                                                  - konec -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci