Současná molekulární biologie vychází z názoru, že základní životní pochody všech živých organismů probíhají v zásadě stejným způsobem a jsou postaveny na stejných biochemických principech. Proto badatelé obvykle postupují podle následujícího schématu:

1. Zvolí se otázka některého základního životního pochodu, např. dělení buněk, dědičnosti nebo přeměny energie.

2. Předběžně se předpokládá, že tento zkoumaný pochod probíhá u všech organismů stejným způsobem, tedy živé organismy používají stejné principy pro dosažení stejného cíle. Proto se pro výzkum zvolí organismus, který je výhodný z technických důvodů.

3. Na takto zvoleném "modelovém" organismu se studuje příslušný životní pochod.

4. Pokud se dospěje k určitým výsledkům, pak se na jejich základě předpoví chování ostatních organismů.

5. Pokud půjde o základní poznatek, prověří se na jiných pokusných objektech. Ověří se, zda výsledek má obecnou platnost. Pokud se objeví výjimka, musí se znovu vymezit nebo zpřesnit původní předpověď.

V dějinách molekulární biologie se volba vhodného pokusného organismu ukázala jako rozhodujícím předpokladem významných objevů. V této kapitole budeme studovat klasické modelové organismy z hlediska jejich vzhledu, způsobu života a technických výhod použití ve výzkumu.

Molekulární biologie se často zaměřila na nejmenší organismy, u nichž se ještě projevuje životní pochod, který chceme studovat. Důvodem je především to, že velikost a složitost spolu přímo souvisí. V mikroskopickém světě jsou živé organismy stavěny z nutnosti co nejjednodušeji. Čím jsou menší, tím méně mohou obsahovat stavebních prvků. Cílem molekulárních biologů je porozumět životním pochodům, tedy popsat je nejen biologicky, ale především fyzikálně a chemicky. Z tohoto praktického důvodu musí být popisované životní pochody co nejjednodušší. Například již u baktérií lze studovat procesy růstu, přeměny energie, pohybu a dědičnosti. Tyto základní jevy nejsou překryty mnohými složitostmi, jak je tomu u vyšších rostlin a živočichů. Mnohé baktérie proto k objevům molekulární biologie přispěly zásadním způsobem, zejména baktérie Escherichia coli. Tato baktérie se vyskytuje v tenkém střevě každého zdravého člověka a podílí se na metabolismu živin. Ve světelném mikroskopu se tato baktérie jeví jako silnější tyčinka o délce asi 0,003 mm a o průměru asi 0,001 mm. Pro pozorování vnitřních struktur této baktérie je nutné použít elektronový mikroskop. Bakteriální buňky jsou zpracovány buď metodou stínování nebo metodou negativního barvení. Na povrchu baktérie Escherichia coli jsou pak pozorovány dlouhé bičíky, které vyčnívají na různých místech buněčného povrchu.

Proces buněčného dělení lze pozorovat i ve světelném mikroskopu. Jakmile buňka dosáhne určité velikosti, buněčná stěna se uprostřed buňky zaškrtí a rozdělí se na dvě tyčinky přibližně stejné délky. V laboratoři se baktérie pěstují obvykle na živném médiu. Živné médium je žlutohnědý čirý roztok, který obsahuje aminokyseliny, extrakt z kvasnic, soli a glukosu. Aminokyseliny a kvasničný extrakt dodávají stavební složky pro výstavbu makromolekul. Kvasnice poskytuje vitaminy, glukosa je zdrojem energie. Toto médium je z hlediska chemického těžko definovatelné. Pro buňky Escherichia coli (dále jen E.coli) představuje toto médium optimální prostředí pro růst a dělení. Tuto baktérii však lze pěstovat i na tzv. minimálním médiu, které je chemicky dobře definované. Skládá se pouze z různých solí a z glukosy. Buňky E.coli jsou v něm nuceny budovat všechny své ostatní složky metabolismem a buněčnou syntézou.

Pokud potřebujeme získat dostatek buněk E.coli, stačí kapku zásobní kultury přenést sterilním platinovým drátkem do skleněné baňky s kompletním médiem. Baňka se pak nechá protřepávat při teplotě 37 stupňů Celsia. Za několik hodin již lze pouhým okem pozorovat obláčky zákalu.

V jednom krychlovém centimetru je více než miliarda buněk E.coli. Je to způsobeno růstovou křivkou, která má exponenciální charakter. Z jedné buňky vznikají dvě, ze dvou čtyři, ze čtyř osm atd. Pokud by byl dostatek látek v živném médiu, růst buněk by probíhal podle exponenciální růstové křivky. Za dvě hodiny vznikne šest generací E.coli, tedy z jediné buňky jich vznikne 2^5, tj. 32.

Tyto úvahy ukazují, že jednoduchá stavba mikroorganismů není jedinou výhodou pro výzkum. Na velmi malém prostoru lze zkoumat průměrné chování velkého počtu jedinců. Jednotlivé odchylky chování jsou velmi malé a obvykle nepozorovatelné. Vědec při zkoumání vyšších organismů takové možnosti nemá. Musí provádět měření na rozsáhlých skupinách organismů a pak statisticky stanovit, zda střední hodnota naměřených údajů v jedné skupině je významná (signifikantní) ve srovnání s jinou skupinou nebo jde pouze o náhodné individuální odchylky. Je nutné použít aparátu matematické statistiky a vhodných statistických testů, u nichž pak mohou být problémy s jejich správnou interpretací.

Ke stanovení počtu bakteriálních buněk se používají dvě metody. Jedna je založena na počítání pod mikroskopem. Používá se k tomu počítací komůrka s kalibrovanou mřížkou. Druhou metodou je "vylévání na plotny". Připraví se živný agar, což je látka z mořských řas, která tvoří rosol. Agar se nejprve smísí s živným médiem a za horka se sterilizuje. Teplem agar zkapalní a rozpustí se v živném médiu. Kapalina se za horka naleje na Petriho misky a ztuhne v nich, takže má opět rosolovitou konzistenci. Bakteriální kultura se zředí asi milionkrát a na povrch agaru se kápne asi 0,1 krychlového centimetru kultury. Poté se kultura rovnoměrně rozetře po povrchu agaru. Petriho misky se pak na noc uloží do termostatu a druhý den ráno lze nalézt v závislosti na hustotě původní kultury asi deset až pět set nových kolonií buněk, které mají průměr asi dva až tři milimetry. Každá tato kolonie vznikla z jedné mateřské buňky. Pokud kolonie spočteme a vezmeme v úvahu ředění, získáme dostatečně přesný odhad pro původní počet buněk. Tento princip, kdy z jediné buňky se získá viditelná kolonie buněk, patří k zásadním principům pro studium mikroorganismů. Růstem oddělených kolonií získáme bez problémů geneticky čistou skupinu s identickou dědičnou výbavou. Taková skupina identických jedinců se nazývá klon. Tyto technické základy bakteriologie byly vyvinuty již kolem roku 1885 v laboratoři Roberta Kocha.

V oblasti rozměrů menších než 0,001 mm začíná říše virů. Otázka podstaty virů je jedním z ústředních problémů molekulární biologie. Viry často vystupují jako původci nemocí u baktérií, vyšších rostlin a živočichů. Určité příznaky, tj. symptomy, onemocnění vyvolané u hostitelského organismu pomáhají určit, o jaký druh viru jde. Chřipka, dětská obrna, neštovice jsou vyvolány viry stejně tak, jako některé druhy rakoviny. U rostlin se symptomy onemocnění vyvolané virem projeví během několika dní od téměř nepozorovatelných poruch růstu až k uschnutí celé rostliny. U živočichů se rovněž projevuje chorobný růst a reakce přecitlivělosti. I u nejprimitivnějších hostitelských organismů, u baktérií, zjistíme po virové infekci celé spektrum symptomů. Bakteriální virus, bakteriofág, může nepozorovaně proniknout do hostitelské bakteriální buňky a tam se ukrývat, zatímco se baktérie množí. Jindy zase může virus okamžitě zastavit syntézu všech makromolekul bakteriální buňky a může způsobit syntézu makromolekul viru, čímž v bakteriální buňce vznikne velké množství bakteriofágů, které buňku usmrtí a rozpustí její buněčnou stěnu. Tím se bakteriofágy uvolní a mohou napadnout další bakteriální buňky. Podle druhu bakteriofágu z jedné bakteriální buňky může vzniknout jen několik set až dvacet tisíc bakteriofágů.

Pokud k baktériím přidáme roztok obsahující fágy, uvidíme za několik hodin ve vrstvě baktérií kulaté otvory o průměru jen několika málo milimetrů, které označujeme podle jejich objevitele d'Herellea jako plaky. Plak je místo, které vznikne tam, kde jsou bakteriální buňky usmrceny fágovou infekcí. Infekce vzniká od jedné fágové částice. Po rozpadu bakteriální buňky nové fágové částice napadnou další okolní bakteriální buňky. Po několika hodinách baktérie vyčerpají živné médium a jejich růst se zpomalí a ustane tak i produkce nových fágů. Díky procesu buněčného množení lze tedy pouhým okem vidět, kde se na začátku pokusu usadila fágová částice.

Tato jednoduchá biologická metoda je nesmírně citlivá a velice účinná pro zjišťování virů. K jejímu provedení je potřeba mít nějaké skleněné misky, zařízení pro kontrolu teploty a živné médium. Chemicky nelze tak malé množství hmoty, jako je virová částice, vůbec prokázat. Elektronový mikroskop je schopen zobrazit jednu virovou částici, ale při zpracování výchozího materiálu musíme vyjít z několika miliónů virových částic. Plakovou metodou lze pak najít příslušný virus, pokud vytvoří své potomstvo v živném médiu prostřednictvím hostitelských buněk.

Důsledkem virové infekce však nemusí být v každém případě usmrcení a rozpad hostitelské buňky. Může dojít k tomu, že fág po vniknutí do hostitelské buňky se nijak neprojevuje a hostitelská buňka žije zdánlivě zdravě dále. Dceřinné buňky vzniklé z takto napadené hostitelské buňky se pak rozpadnou a uvolní stovky virových částic. Dnes již existují důkazy, že podobné virové částice jsou zodpovědné za určité typy rakoviny.

Případy, které leží mezi výše uvedenými extrémy, pozorujeme často u virů infikujících rostliny. Nejznámější je virus tabákové mozaiky, který vytváří neuvěřitelně početné potomstvo u některých druhů tabáku, přičemž rostlina může dále růst, kvést a vytvářet semena.

Viry společně se svými hostitelskými organismy jsou velmi dobrými modely pro studium dědičnosti. U virů lze studovat, jak vzniká jejich biologická struktura makromolekul. Bakteriofágy jsou obzvláště vhodné pro kvantitativní experimenty. Díky plakové metodě lze prokázat jednu virovou částici a není obtížné vyrobit milióny virových částic na nepatrném prostoru. Rostlinné viry sehrály důležitou úlohu při chemickém a fyzikálním výzkumu biologických struktur, protože je snadno lze získat v čistém stavu a dokonce v gramových množstvích. Živočišné viry se objevily v molekulární biologii mnohem později. Z technického hlediska je s nimi nejvíce potíží. Nejprve se musela vypracovat metoda kultivace živočišných buněk a teprve bylo možné pomýšlet na exaktní výzkum. Virologie živočichů navázala nejdříve na výsledky studia bakteriofágů a rostlinných virů. Dnes patří k velmi zajímavému odvětví, protože na modelových systémech lze studovat důležitá onemocnění zvířat a člověka.

Velký počet zkoumaných jedinců usnadňuje kvantitativní vyhodnocení pokusů pomocí matematické statistiky aplikované na rozsáhlé populace. Malé rozměry podmiňují poměrně jednoduchou vnitřní stavbu organismu a umožňují popsat životní pochody pomocí fyziky a chemie. Značná část virového výzkumu je založena na srovnávací metodě, kdy se srovnávají dvě populace, infikovaný a zdravý hostitelský organismus. Životní pochod tedy lze pochopit i tím, že studujeme rozdíl mezi dvěma složitými organismy. Ačkoliv je dnes možné živočišné buňky vyjmout z organismu a kultivovat je, jsou přece jen mnohem složitější, než bakteriální buňky. Víme mnohem méně o jejich růstu, strukturální výstavbě a jejich dělení. Velký význam má nyní to, že rozumíme způsobům množení virů v živočišné buňce. Experimentátor může určit začátek virové infekce a utvořit si obraz o pochodech vyvolaných infekcí tím, že srovnává v různých intervalech rozdíly mezi měřenými hodnotami u zdravé a u infikované populace buněk.

Srovnávací metoda má zásadní význam také při studiu dědičnosti. Více než před sto lety objevil Gregor Mendel základy tohoto vědeckého odvětví, přičemž jeho pokusným objektem byl hrách. Jeho objevy byly umožněny tím, že sledoval jednoduché rozdíly mezi odrůdami stejného druhu a nikoliv celek těchto složitých organismů.

Po znovuobjevení Mendelových zákonů v moderní genetice sehrály důležitou úlohu dva organismy. Jedním z nich je houba Neurospora, která ve srovnání s baktériemi je kvalitativně vyšším organismem. Baktérie nemají pravé buněčné jádro. Neurospora má již ohraničené buněčné jádro, které je charakteristické pro všechny vyšší organismy. Z historického hlediska výzkum Neurospory představuje kompromis mezi botanikou a chemií. Genetik Beadle a chemik Tatum se shodli na tomto organismu a zahájili výzkum, který posléze vyústil v dnešní těsné sepjetí genetických a biochemických studií. Asi v roce 1940 oba vědci začali pátrat po dědičně pozměněných jedincích této houby, kteří ztratili schopnost syntetizovat některé vitaminy. V Evropě pracovaly dvě skupiny vědců, kteří zkoumali genetickou podmíněnost barvy očí u hmyzu. Američané Beadle a Tatum byli těmito výzkumy podníceni a naplánovali pokusy s Neurosporou. Houba Neurospora crassa má dvě důležité výhody, které se uplatní při systematickém pátrání po dědičných změnách biochemických procesů. První výhodou je možnost pěstovat tuto houbu na definované živné půdě, podobné minimálnímu živnému médiu pro baktérii Escherichia coli, tj. v podstatě směsi solí a glukosy. Druhou výhodou je, že dědičné změny zjistíme snáze než u hmyzu, obratlovců a vyšších rostlin, protože tato houba má jen jedinou sadu dědičného materiálu, zatímco jmenované organismy mají dvojí sadu. Podobně jako baktérie můžeme tuto houbu kultivovat v Petriho miskách se živným agarem. Na živném agaru houba tvoří povlaky podobné bavlně nebo plsti, které jsou podle druhu Neurospory oranžové nebo bílé. Povlak se skládá z jemných vláken, hyfů, které jsou vlastně řetězce buněk ležících hustě vedle sebe. Tato vlákna vyklíčí z výtrusů a rostou neomezeně dále, až vytvoří na živném médiu plstěný povlak, podhoubí. Vlákna podhoubí jsou dvojího druhu, samčí a samičí. Pokud se samčí a samičí vlákna při růstu na živném médiu setkají, splynou a vytvoří potomstvo ve formě nových výtrusů. Rozdíl v pohlaví je přitom uložen již ve výtrusu. Tyto výtrusy jsou umístěny v malých vřeckách a množství takových vřecek je vměstnáno v klubíčku vláken o velikosti špendlíkové hlavičky. Při tvorbě výtrusu dochází k dělení dědičného materiálu, k jehož smísení došlo splynutím pohlavních buněk. Vřecka lze pěstovat dokonce v tekuté kultuře podobně jako bakteriální hmotu.

Druhým organismem je octomilka (Drosophila melanogaster), která představuje již značně složitý organismus. Vývoj jedince vede od vajíčka přes larvu a její zakuklení k dospělé mouše. Celý životní cyklus trvá necelé dva týdny a v laboratoři se odehrává většinou v lahvích s trochou kukuřičné kaše. U Drosophily lze podle vnějších znaků rozlišit pohlaví. Sameček je o něco menší než samička a má tmavě zbarvenou zadní část těla, zatímco samička má tuto část černožlutě pruhovanou. Kolem roku 1910 rozpoznal Američan T.H. Morgan vhodnost tohoto organismu pro studium genetiky. Jeho výzkumy spadají ještě do doby před vznikem molekulární biologie, avšak představují první systematický přístup je studiím organizace dědičného materiálu. Dědičné znaky, které byly v Morganově době jediným prostředkem, jak získat nepřímé informace o organizaci dědičného materiálu, se týkaly vnější morfologie much: tvaru křídel, typu obrvení, vzhledu a barvy očí. Teprve deset let po klasických studiích na Drosophile byla objevena další významná přednost této mouchy a rovněž některých jiných much a komárů. Buňky většiny tkání tohoto hmyzu obsahují tisíckrát větší chromosomy, než je tomu u buněk jiných organismů. Chromosomy jsou v buňce nositelé dědičné informace, protože obsahují kyselinu desoxyribonukleovou. Mikroskopicky bylo možno pozorovat jednotlivé chromosomy a tím se odstranilo mnoho pochybností, které se při použití nepřímého pozorování dědičných znaků objevovaly.

Sám člověk může být pokusným objektem molekulární biologie. Přirozeně, člověk má mnoho nevýhod jako pokusný objekt. Sled jeho generací je asi tisíckrát pomalejší než u Drosophily a plánované pokusy křížení nepřicházejí z etických a psychologických důvodů v úvahu. Naproti tomu je dějinnou skutečností, že zcela některé základní objevy molekulární biologie byly učiněny studiem člověka.

Uvedené nevýhody jsou totiž vyváženy některými zásadními výhodami. Klinické pokusy na celém světě představují již připravený materiál údajů. Pomalá generační doba a početně nepatrné potomstvo jsou nahrazeny popisy rodokmenů za celá staletí. Nesmíme podceňovat ani skutečnost, že člověk a jeho zdraví leží na srdci většině lidí a proto jsou lékařské výzkumy podporovány finančně i morálně veřejností, což opět vede k rozšiřování datových materiálů. Teprve asi v 60.letech 20.století byla znovuobjevena kniha anglického lékaře Garoda "Vrozené chybné funkce látkové přeměny", kterou napsal v roce 1908. Na základě lékařských pozorování dědičně nemocných lidí byly v této knize učiněny závěry, které došly veřejného uznání až teprve později, díky cílenému výzkumu Beadla a Tatuma.

Výzkum v molekulární biologii postupuje od pochopení částí k pochopení celku. Jestliže chceme mít naději na fyzikálně chemické pochopení určitých jevů, vyjmeme ze složitých organismů poměrně jednoduché části a studujeme jejich funkci za přesně definovaných laboratorních podmínek. Vyšší živočichové jsou k tomuto účelu vhodnější než vyšší rostliny, neboť různé životní funkce jsou u nich vykonávány prostorově oddělenými a vysoce specializovanými skupinami buněk. Pokud nás například zajímá molekulární mechanismus dýchání, zabýváme se červenými krvinkami. Pro výzkum si můžeme opatřil litry zvířecí krve a jednoduchým odstředěním oddělíme červené krvinky od séra. Specializace červených krvinek zasahuje do oblasti makromolekul, protože větší část bílkovinných molekul syntetizovaných těmito buňkami představuje jediná bílkovina, hemoglobin. Hemoglobin se proto získá v čistém stavu poměrně snadno a dnes jej lze zakoupit za přiměřenou cenu u biochemických firem. Vyčištěný hemoglobin může ve vodném roztoku obsahujícím soli vykonávat přesně tu funkci, kterou splňují neporušené červené krvinky v celém organismu: vázat nebo odevzdávat kyslík a oxid uhličitý podle vnější nabídky těchto plynů. Kdo se zajímá o fyzikálně chemické základy tohoto procesu, bude raději provádět pokusy v reagenčních nádobách naplněných roztokem hemoglobinu než na celém živočichu - viz příloha 6.

Můžeme se například zajímat o molekulární mechanismus, který je základem mechanických výkonů těla. Sval se skládá především ze svalových buněk, jejichž úkolem je smršťovat se a tak působit proti vnějším silám. Součásti svalových buněk slouží tedy jednak ke kontrakci a jednak k získání energie metabolismem glukosy, která je přiváděna krví. Kontraktilní aparát buňky je složen především ze dvou typů svalových bílkovin. Svalové bílkoviny lze extrahovat roztokem solí a v modelovém pokuse ve zkumavce můžeme napodobit jednotlivé dílčí stupně svalové kontrakce. Avšak i tento vyjmutý díl organismu je natolik složitý, že výzkum probíhá již několik desítek let. Na hemoglobinu a bílkovinách svalu vidíme neustálé úsilí molekulárních biologů uskutečnit ve zkumavce, "in vitro" procesy, které se odehrávají pouze v živém organismu, "in vivo".

Dalším příkladem specializovaného buněčného typu u obratlovců jsou samčí spermie. Jejich úkolem je dopravit samčí dědičný materiál k samičím vaječným buňkám. Dědičný materiál, desoxyribonukleová kyselina (DNA) je proto zhuštěn v "hlavičce" spermie a zbývající část spermie je jen bičík, který slouží spermii k pohybu. Koncentrovaný dědičný materiál lze získat z mlíčí sleďů. Friedrich Miescher, objevitel deoxyribonukleové kyseliny, o jejíž funkci nic nevěděl, použil spermie rýnských lososů jakožto výchozího materiálu pro vyčištění a chemickou analýzu DNA. Rok předtím, v roce 1887, nalezl DNA v jádrech buněk v hnisu.

Posledním příkladem, který dobře vystihuje "části" komplexního organismu, jsou tkáňové struktury. Používá se jich převážně při studiu dělení buněk a jejich diferenciaci. V kulturách živočišných buněk se vychází buď z embryonálních buněk nebo nádorových tkání. V obou případech se buňky velice rychle dělí. Používanými dárci těchto buněk jsou myši, krysy, křečci, kuřata a také člověk. Pro kultivaci embryonálních buněk se používá orgánů jako jsou ledviny, sval, oční čočka. Živočišné buňky mají vysoké nároky na živné médium a musí být pečlivě chráněny před infekcemi různými mikroorganismy. Rostou však za optimálních podmínek neomezeně dlouho. Můžeme proto mít mnoho kultur buněk, jejichž jediný dárce - pokusné zvíře nebo člověk s nádorem - zemřel třeba před několika desítkami let. Tkáňové struktury lze připravit i z vyšších rostlin, protože i rostliny mohou onemocnět rakovinou. Jakmile jsou tkáně infikovány, může se v nich virus udržet několik desítek let. Oproti tkáňovým kulturám živočišných buněk mají rostlinné kultury schopnost regenerovat celý organismus, pokud na ně působíme vhodnými růstovými hormony. Tímto způsobem můžeme zjistit určité dědičné rozdíly, které se neprojeví ve shlucích buněk.

- pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci