Přírodní věda může přijmout pouze takové tvrzení, o němž je známo, jak se k němu došlo. Číselný údaj, i když přesný, nemůže být respektován, pokud není uvedena metoda měření. Jestliže budeme popisovat výsledky molekulární biologie, musíme také popsat techniku, kterou jsou tyto výsledky vytvářeny. Prostudujeme postupně biologická, chemická a fyzikální zařízení, která se používají v molekulárně biologických ústavech, ikdyž se nemusí vyskytovat na jediném pracovišti.

Organismy používané pro vědecké účely se většinou pěstují za kontrolovaných podmínek přímo ve vědeckých ústavech. Dává se přednost mikroorganismům nebo kulturám živočišných buněk. K tomuto účelu se používají různé druhy termostatů, skříňové nebo komorové, jejichž účelem je udržet stálou teplotu. Přídatná zařízení slouží k udržování buněk v pohybu, čímž se zabraňuje jejich shlukování a zajišťuje se dostatečný přísun kyslíku. Mikroorganismy se proto vydatně protřepávají, míchají nebo se přímo do kultur vhání vzduch. Buňky savců jsou křehčí, proto se jimi jen zlehka pohybuje, aby nedošlo k jejich poškození. Nejdůležitejším opatřením je přísná sterilita, tedy ochrana před nežádoucími zárodky. Zejména u živočišných kultur je tato ochrana velmi náročná, protože zmíněné zárodky, zejména pak plísně, rostou mnohem rychleji než vlastní kultury buněk. Všechny předměty a látky užité při kultivaci buněk jsou vystaveny účinku přehřáté páry v tlakových nádobách a nežádoucí zárodky jsou tak ničeny. Pracovní pomůcky, jako jsou pinzety a očkovací jehly jsou před vlastní prací ještě jednou sterilizovány v plameni. Používá se také ultrafialových zářičů pro ničení nežádoucích mikroorganismů.

Molekulární biologie je základní výzkum. Vybírají se organismy podle hledisek laboratorní praxe. Výběr se vyhýbá patogenním mikroorganismům, které vyvolávají choroby. Pracovníci proto nemusí dělat zvláštní opatření, aby se uchránili před nákazou.

Kromě mikroorganismů a buněk savců se často musí použít vyšší organismy. Nejčastěji se v ústavu chovají drobní hlodavci, jako myši, křečci, krysy a králíci. Slouží jako pokusné objekty nebo jako hostitelé virů a rakovinných buněk. Králíci se chovají většinou jako producenti antisér. Pěstují se také rostliny, které jsou zdrojem chloroplastů, nositelů zeleného rostlinného barviva a slouží jako hostitelé rostlinných virů. I tyto vyšší organismy je třeba chránit před choroboplodnými zárodky, které při pokusech mohou vést ke zcela mylným závěrům.

Molekulární biologie ke své práci potřebuje biochemické laboratoře. Pokusy se obvykle začínají provádět se zcela rozdrceným materiálem a jeho homogenizací. Jsou připravovány roztoky, které obsahují velký počet molekul. K tomu se používají homogenizační přístroje. Používá se zařízení podobné kuchyňskému mixéru, který je naplněn chlazeným roztokem soli, do kterého přechází buněčný obsah. Baktérie lze rozdrtit v lékárnické třecí misce za pomocí jemného křemenného písku. Ultrazvukový generátor, který vytváří zvuk o vysoké frekvenci a energii, rozruší tužší buněčné struktury v buněčných suspenzích. Při homogenizaci vzniká hustý roztok, ve kterém jsou soli, barviva, makromolekuly, zbytky buněčných stěn i celé buňky, které se nepodařilo rozdrtit. Protože biochemika zajímají pouze ty látky, které přešly do roztoku, odstraní hrubé částice odstředěním. V laboratořích je celá řada odstředivek, od takových, které mají jen několik set nebo tisíc otáček za minutu, až k preparativním ultracentrifugám s více než 60 000 otáčkami za minutu. Tyto přístroje je nutné chladit, aby se uchovaly buněčné homogenáty v chladu a nedocházelo k biochemickým procesům a buněčným přeměnám. Labilní molekuly, které jsou v organismu neustále nahrazovány, by se teplem rozpadly. Tento neřízený průběh by zakrátko zcela znemožnil studium celého systému. K uchování získaného roztoku se proto používají mrazící boxy a komorové lednice, do kterých lze přenést celé přístrojové vybavení laboratoře.

Pro odstranění zbytků buněk stačí odstřeďování vzorku v centrifugách při několika tisících otáček za minutu. Vzorky nalejeme do kyvet, které jsou vyráběny z nejrůznějších materiálů, obvykle ze skla nebo plastických hmot. Kyvety se vzorkem se umístí do rotoru centrifugy, který bývá nejčastěji úhlový nebo výkyvný. Úhlový rotor má tvar komolého rotačního kužele a kyvety se vkládají do otvorů vyvrtaných rovnoběžně s jeho stranou. U výkyvného rotoru jsou kyvety umístěny do kovových pouzder, která visí na čepech vlastního rotoru, křížového nebo hvězdicového tvaru. Při rozběhu se pouzdra vychýlí a jejich osa je kolmá k ose rotoru. Odstřeďované částice klesají vlivem centrifugační síly ke dnu kyvety. Rychlost tohoto klesání (sedimentace) závisí na velikosti a hustotě částic a na velikosti odstředivé síly. Tato síla se zvětšuje s druhou mocninou počtu otáček a s poloměrem rotoru (vzdálenost částice od středu rotace). Pro srovnání výpočtů se udává místní odstředivé zrychlení v násobcích tíhového zemského zrychlení, které je 1 g. Zatímco u odstředivek s několika tisíci otáčkami za minutu dosahuje tato hodnota jenom několik tisíc g, dosáhne se v ultracentrifugách při více než 60 tisících otáček za minutu hodnot až několika miliónů g.

Technické problémy, které při tom vznikají, vyvstanou nejlépe při srovnání preparativní ultracentrifugy a běžné laboratorní centrifugy. Vysoce výkonný elektrický motor a dokonalá převodová skříň musí být takové kvality, aby zajistily provoz po dobu třeba i dvou dní a to při maximálních otáčkách. Samotný rotor musí bezpečně vydržet ohromné odstředivé síly a proto je vyráběn se speciálních slitin, pro špičkové výkony z titanu. K ochraně proti explozivnímu roztržení je rotor umístěn do silné kovové komory. Potíže při vysokých otáčkách vznikají třením kovu rotoru o vzduch. Proto je jednak celá pancéřová komora chlazena a jednak se vzduch z komory odčerpává pomocí rotační nebo difúzní vývěvy. Cena špičkových centrifug je proto srovnatelná s cenami nejdražších automobilů. Ultracentrifuga je schopna odstředit nejen pevné viditelné částice, nebo viry a ribosomy, ale také bílkoviny a nukleové kyseliny.

Tento proces lze sledovat v dalším přístroji, analytické ultracentrifuze. Slouží nejen k přípravě vzorků, ale také k jejich zkoumání. Kromě částí, které lze nalézt v preparativní centrifuze, jsou zde složité optické systémy a plně automatické fotografické zařízení, případně mikroskopické kamery založené na technologii CCD prvků, jejichž výstup je napojen na počítač. Aby bylo možno pozorovat vzorek při vysokých otáčkách (např. centrifuga Spinco E má až 68 000 otáček za minutu), vkládáme je do speciální kyvety. Má tvar válce, ve kterém je válcová výseč s osou rovnoběžnou k ose rotace a je kolmo k ní omezena křemennými nebo safírovými planparalelními okénky. Tím může kyvetou procházet nejen viditelné světlo, ale také ultrafialové záření.

Buněčný homogenát obsahuje kromě makromolekul také malé molekuly, jako jsou volné aminokyseliny, cukry, barviva. Jednoduchá účinná metoda k jejich odstranění je dialýza. Vzorkem se naplní sáček nebo trubice z celofánu nebo obdobného polopropustného materiálu. Sáček nebo trubici pečlivě uzavřeme a vložíme jej do roztoku soli. Celofán působí jako polopropustná (semipermeabilní) membrána. Malé molekuly pronikají ze sáčku do okolního prostředí a tím jejich koncentrace klesá, zejména pokud okolní slaný roztok neustále vyměňujeme. Pro makromolekuly jsou póry celofánu příliš malé, proto zůstávají v sáčku. Po několika hodinách nebo dnech získáme roztok makromolekul zbavený přítomnosti rušivých nízkomolekulárních látek.

Dalším zpracováním makromolekulárního roztoku může být frakcionace v kolonách. V nejjednodušším případě je kolona skleněná trubice o světlosti (vnitřním průměru) jednoho až několika centimetrů a délce asi 10 centimetrů až do jednoho metru. Kolona je umístěna svisle a přechází do malé nálevky, která je uzavřena skleněnou fritou nebo filtračním papírem. Náplň kolony, složená ze zrnitého materiálu, pak nemůže vytékat.

Podle účelu, kterému kolona slouží, bývá naplněna nejrůznějším materiálem, od anorganického fosforečnanu vápenatého až k organickým umělým pryskyřicím. Při průchodu roztoku touto náplní dochází k rozdělení (frakcionaci) látek v roztoku obsažených. Z našeho buněčného homogenátu jsme již odstranili nerozpustné části centrifugací a nežádoucí soli a malé molekuly dialýzou. Nyní několik mililitrů tohoto roztoku naneseme na horní část kolony. Vzorek se vsákne a začneme jej pomalu promývat roztokem soli, který po průchodu odkapává z kolony. Molekuly vzorku jsou jednak strhávány proudem roztoku a jednak se zachytávají na částicích náplně kolony. Jednotlivé makromolekuly našeho vzorku se liší stupněm přilnavosti k částicím náplně kolony. Proto kolonou procházejí rychleji ty makromolekuly, které mají nižší přilnavost. Pokud molekuly látky A procházejí kolonou rychleji než molekuly látky B, pak při odchodu z kolony se nejprve objeví jen několik molekul látky A, později se objeví hlavní podíl a nakonec ještě několik opožděných molekul. Množství molekul látek A má normální rozdělení v čase. Biochemik sleduje maximum tohoto množství - vrchol látky A.

Pokud potřebujeme pracně dosažené rozdělení látek zachovat, nemůžeme je zachycovat do jedné nádoby. Frakcionaci obstarává sběrač frakcí, který je složen z plechového kotouče s mnoha otvory, v nichž stojí v soustředných kruzích zkumavky na zachycování jednotlivých frakcí. Automatické zařízení lze ovládat například počítačem kapek, který zařídí, že po určitém počtu kapek se zařízení posune na další zkumavku. Původní buněčný extrakt je tak rozdělen do několika stovek frakcí. Pokud se biochemik zajímá například o bílkoviny nebo nukleové kyseliny, může jednotlivé frakce automaticky měřit. Vytékajícím vzorkem prochází paprsek UV záření, který je propouštěn čirým roztokem, ale je zadržován vysokomolekulární látkou. Velikost pohlcování je závislá na koncentraci látky v roztoku. Ve spojení například s počítačem lze tak vykreslit frakční křivku, která zobrazuje závislost pohlcování záření (a tedy koncentrace některé látky) v závislosti na čase.

Frakční křivka má několik maxim a minim a obvykle tvar křivky v okolí maxima odpovídá křivce hustoty normálního rozdělení. Každé maximum odpovídá vrcholu některé látky (přesněji řečeno směsi látek) z původního vzorku. Nelze očekávat, že jedinou frakcionací získáme čistou látku. V nejjednodušších buňkách je několik tisíc různých bílkovinných látek. Frakcionaci je nutné několikrát opakovat za různých podmínek a proto taková práce může trvat několik týdnů.

Další metodou oddělování látek na koloně je chromatografie. První chromatografii provedl v roce 1906 ruský botanik Cvet, když chtěl rozdělit dvě barviva vyskytující se v listech. Na sloupci kolony, kterou použil, mohl sledovat proces dělení pouhým okem. Cvet získal dva zelené pruhy, obě listová barviva chlorofyl A a chlorofyl B a několik žlutých barviv karetonoidů. Cvetův objev přišel pro jeho současníky poněkud předčasně a teprve za deset let byl rozpoznán velký technický význam tohoto způsobu dělení.

Dnešní chromatografie je fyzikální metoda na selektivní dělení složek směsi. Je založena na odlišnosti jednotlivých složek směsi, které se mají dělit, pokud jde o jejich afinitu (přilnavost) ke dvěma vzájemně nemísitelným fázím, s nimiž jsou ve styku. Pokud se uvede jedna fáze do pohybu vůči druhé, nastává chromatografické dělení. Jedna fáze je stacionární (nepohyblivá), obvykle povrchově aktivní látka, adsorbent, papír nebo kapalina nanesená na vhodný pórovitý nosič. Druhá fáze je mobilní (pohyblivá) a tvoří ji roztok nebo plyn.

Podle druhu pohyblivé a nepohyblivé fáze se rozeznává chromatografie adsorbční (plyn, adsorbent), rozdělovací (kapalina, kapalina), papírová (chromatografický papír, kapalina), plynová (kapalina, plyn).

Při adsorbční chromatografii se zkoumaný roztok obsahující směs látek filtruje sloupcem adsorbentu umístěném ve skleněné koloně. Jednotlivé složky směsi se adsorbují v zónách nad sebou. V horní části adsorbentu se zachytí látky, které mají největší adsorbční afinitu vzhledem k použitému adsorbentu. Po vytvoření zón se jednotlivé složky směsi izolují tzv. elucí (promýváním) kolon čistým rozpouštědlem. Zóny se přitom posunují dolů a oddělují od sebe. Pokud jsou tyto zóny barevné, lze přímo pozorovat jejich umístění. U bezbarvých látek se ke zjištění poloh zón používá indikátorů, barevných reakcí, fluorescence v ultrafialovém záření apod. Adsorbční chromatografie je vhodná pro preparační účely.

Při rozdělovací chromatografii se využívá rozdílu rozdělovacích koeficientů oddělovaných látek pro dvě vzájemně omezeně mísitelné kapaliny. Rozdělovací koeficient je poměr koncentrací látky rozpustné ve dvou vzájemně se stýkajících a nemísitelných kapalinách. Významné místo v rozdělovací chromatografii hraje papírová chromatografie, kde je stacionární fáze (obvykle voda) nasávána speciálně upraveným filtračním papírem. Jednotlivé skvrny na chromatografickém papíře se detekují vhodnou barevnou reakcí, čímž vzniká chromatogram. Rozdělovací chromatografie je velmi účinná dělící metoda užívaná jak pro preparační tak pro analytické účely. Lze takto například stanovit cukry, aminokyseliny a alkaloidy.

Další oddělovací metodou je elektroforéza. Některé molekuly jsou elektricky nabité. Například molekula kyseliny glutamové má celkový záporný náboj. Záporný náboj jedné karboxylové skupiny se vyrovnává s kladným nábojem aminové skupiny. Záporný náboj druhé karboxylové skupiny vede k zápornému náboji celé molekuly. Elektroforetická aparatura se v různých provedeních vyskytuje téměř ve všech biochemických laboratořích. Popíšeme její nejjednodušší variantu, kterou je elektroforéza na papíře. Její nejdůležitější částí je usměrňovač, který mění střídavý elektrický proud na stejnosměrný. Vlastní elektroforetický přístroj je složen ze dvou nádobek spojených nevodivým můstkem. Do obou nádobek nalejeme roztok soli a přes můstek položíme navlhčený proužek filtračního papíru, jehož konce jsou ponořeny do nádobek. V každé nádobce je elektroda, většinou z platiny, z nichž jedna je spojena s kladným a druhá se záporným pólem usměrňovače. Nyní naneseme zkoumaný vzorek napříč do středu papíru. Může jít o buněčný extrakt nebo například o krevní sérum. Velmi často se této metody používá pro oddělení bílkovin. Elektrický náboj bílkoviny je součtem nábojů jejích aminokyselin. Většinou jsou bílkoviny nabité záporně, některé kladně. Při zapojení elektrického proudu dojde k oddělování různě nabitých bílkovin. Rozhoduje přitom velikost elektrického napětí mezi elektrodami, schopnost bílkovin překonávat odpor kapaliny a zachytávání na celulosových vláknech papíru. Významnou roli hraje i tvar dělených makromolekul.

Princip elektroforetického oddělování látek na základě různých rychlostí pohybu makromolekul je používán v nejrůznějších technických variantách. Teoreticky nejjednodušší je volná elektroforéza, kdy oddělované látky procházejí v samotném rozpouštědle. Z praktických důvodů se však používají různé stabilizující nosiče napuštěné rozpouštědlem. V posledních letech se používají různé gelovité látky. Smísením výchozích materiálů ve skleněné trubičce dostaneme malý sloupec gelu. Konce trubičky se spojí s oběma elektrodami, přičemž se rozdělí velmi malá množství látky (desetina až setina mililitru). Bílkoviny lze prokázat například použitím specifického modrého barviva. Po obarvení se objeví na charakteristickém místě barevný proužek. Z polohy proužků a jejich počtu lze o zkoumané bílkovině vyčíst tolik údajů, které se před desítkami let získávaly několik týdnů.

Další metoda je radioaktivní metoda značení látek. Princip této metody je založen na existenci radioaktivních izotopů prvků. Každý chemický prvek je složen z atomů se stejnými chemickými vlastnostmi, které jsou způsobeny elektronovým obalem atomu. V atomovém jádru však může být různý počet neutronů. Prvky s takovými různými jádry mají stejné chemické vlastnosti, proto se nazývají izotopy. Většina izotopů je nestabilních a jejich jádra se rozpadají na lehčí atomová jádra, přičemž je vysláno záření. Takové izotopy se nazývají radioaktivní. Molekulární biologie používá většinou následující radioizotopy (v závorce je uveden počet nukleonů v jádře):

značka      prvek                              poločas rozpadu

H[1]         vodík                              stabilní

H[2]         deuterium                        stabilní

H[3]         tritium                             12,5 roku

C[12]       uhlík                                stabilní

C[14]       radioizotop uhlíku            5568 let

P[31]       fosfor                                stabilní

P[32] radioizotop fosforu                  14 dní

S[32] síra                                          stabilní

S[33] radioizotop síry                       87 dní

Pro posouzení praktického využití izotopu je důležitý druh záření, který izotop vydává. Při rozpadu jádra působením slabé jaderné interakce hovoříme o rozpadu beta, kdy jsou jádrem vysílány elektrony. Izotopy s tímto druhem rozpadu se používají v biologickém výzkumu nejčastěji. Při rozpadu vznikají elektrony s různou energií. Elektrony s nízkou energií se označují jako měkké záření beta, elektrony s vysokou energií se označují jako tvrdé záření beta. Tvrdost záření stoupá od tricia až k fosforu. Pokud dochází k rozpadu jádra silnou interakcí, jsou jádrem vysílány částice alfa, což jsou jádra atomu hélia. Při rozpadu způsobeném elektromagnetickou interakcí jsou vysílány fotony a hovoříme o záření gama. Rozpad radioaktivní látky je charakterizován poločasem rozpadu. Poločas rozpadu je doba, za kterou se rozpadne polovina atomů radioaktivní látky. Stejnou měrou klesá intenzita záření, která je úměrná množství rozpadajících se atomů. Protože vyhodnocování biologických pokusů trvá až několik dní, nelze použít radioizotopy s krátkým poločasem rozpadu.

Jako příklad radioaktivního značení budeme analyzovat bílkoviny, které se za určitých podmínek tvoří v buňkách baktérií. Jak již víme, bílkoviny jsou složeny z aminokyselin. Dnes lze zakoupit radioaktivně značené aminokyseliny, ikdyž za značně vysokou cenu. Použijeme například leucin značený radioaktivním uhlíkem C[14]. Jakmile zkoumané baktérie dobře rostou na živném médiu, přidáme k nim na několik minut tento izotopem značený leucin. Potom rychlým ochlazením zastavíme látkový metabolismus a bakterie zpracujeme homogenizací. Provedeme frakcionaci a z jednotlivých frakcí odebereme vzorky asi jednu setinu až dvacetinu mililitru. Každý vzorek smícháme se scintilačním roztokem v lahvičce se šroubovým uzávěrem. Scintilační roztok je organické rozpouštědlo, jehož chemické vazby přeměňují radioaktivní beta záření na viditelné světlo. Poté jednotlivé lahvičky se vzorky necháme zpracovat scintilačním počítačem, což je zařízení, kde fotobuňka určuje počet světelných záblesků za minutu. Z celého popisu je vidět, že se jedná o náročnou metodu, při které je třeba zachovávat bezpečnostní opatření pro práci s radioaktivním materiálem. Tato náročná metoda se provádí kvůli své vysoké citlivosti, protože lze měřit taková množství látky, která jsou chemickými metodami nezjistitelná.

Radioaktivní metodou lze také sledovat dynamiku biochemických procesů. Můžeme sledovat změny sledované látky ještě před usmrcením organismu. Zatímco chemická analýza podává jen statický obraz, radioaktivním značením lze získat dynamický obraz molekulární stavby buňky. Vedle scintilační metody, kterou se počítají záblesky rozpadu atomů, se používá autoradiografie. Tato metoda slouží k analýze označených bílkovin, které rozdělíme na papíře elektroforézou. Máme-li jen nepatrné množství látky, bylo by obarvení papírového proužku bezvýsledné. Proužek je však radioaktivní. Elektroforetický papír lze rozstříhat na tenké proužky a tyto proužky lze uložit jednotlivě na fotografické desky. Působením radioaktivního záření desky zčernají. Místo obarveného pruhu tedy získáme pruh různě zčernalý a zjistíme tak, kam se radioaktivní bílkovina na papíře dostala.

Radioaktivní metody jsou tedy velmi účinné. Na druhé straně však radioaktivní izotopy mohou v organismu vyvolat různá poškození. Samotné záření může poškozovat živé buňky. Z tohoto důvodu se při práci s radioaktivním fosforem zachovávají velmi přísná bezpečnostní opatření. Experimentátor je chráněn olověným sklem a při manipulaci se vzorkem využívá manipulátorů, jejichž pohyb je řízen lidskou rukou. V dnešních laboratořích se využívá pro manipulaci s radioaktivními vzorky robotů řízených počítačem. Každý experimentátor stále nosí na plášti dozimetr, který indikuje celkovou dávku ozáření.

Velmi nebezpečné je vniknutí izotopu do lidského organismu a jeho vestavění do molekulárních struktur buněk. V tomto případě je nebezpečný i prvek s krátkým poločasem rozpadu. Například fosfor se ukládá ve vláknitých molekulách deoxyribonukleové kyseliny, která je nositelem dědičné informace. Rozpadem radioaktivního fosforu vzniká atom síry, který nemůže udržet původní vazby atomu fosforu a dojde k rozpadu molekuly.

Ze všeho, co dosud bylo popsáno, vyplývá, že jsou kladeny vysoké nároky na technické vybavení. Uvedeme ještě dvě metody, kterými jsou ohyb rentgenových paprsků a elektronová mikroskopie, které umožňují studium prostorových struktur živé hmoty.

Při analýze ohybu rentgenových paprsků je předmětem studia bílkovinný krystal. Bílkovinné krystaly lze jen velmi nesnadno připravit, mnohem nesnadněji, než krystaly anorganických látek. Jedním z důvodů je skutečnost, že bílkovina musí být v roztoku naprosto čistá, tedy musí být přítomen pouze jeden druh molekul. I z vysoce čistého roztoku se podaří krystal připravit jen zřídka.

Pěstování krystalů z vodného roztoku bílkoviny se provádí pozvolnou krystalizací. Čím pomaleji látka krystalizuje, tím větší je naděje, že vznikne dobře vyvinutý krystal. Velikost čtvrtiny milimetru je považována za úspěch.

Krystaly vznikají prostorovým uspořádáním atomů a molekul. Vznik krystalů je dán snahou částic dosáhnout co největší hustoty. Aby vznikl krystal, je nutné, aby byly přítomny pouze molekuly jednoho druhu, protože molekuly různých velikostí a tvarů nemohou vytvořit pravidelný prostorový útvar. Atomy nebo molekuly krystalu zaujímají v prostoru určité uspořádání, kterému se říká krystalová mřížka. Na typu krystalové mřížky pak závisí vnější vzhled krystalu.

Při ozařování krystalu rentgenovým zářením dochází k ohybu paprsků na elektronovém obalu atomových jader. Paprsek se odráží na mřížkových rovinách a odražené paprsky se zesilují nebo ruší díky jejich vzájemné interferenci. Průchod paprsků krystalem lze zachytit na fotografickou desku, na níž vznikne skupina černých skvrn, jejichž polohu a intenzitu lze změřit. Vysoce náročnými výpočty lze z obrazu na fotografické desce rekonstruovat prostorový tvar krystalu. Spolupráce molekulárních biologů s výpočetními pracovišti je nezbytná.

Konečným výsledkem celé této práce je model makromolekuly, o kterém jsme hovořili v předchozí kapitole, tedy buď model z kuliček vzájemně propojených dráty nebo kalotový model. Až budeme hovořit o DNA (desoxyribonukleová kyselina), enzymech nebo o hemoglobinu, setkáme se s výsledky rentgenové strukturální analýzy v praxi.

Elektronová mikroskopie je další metodou molekulární biologie. Umožňuje pozorovat vnitřní stavbu buněk, lze sledovat její jednotlivé organely, které jsou v běžném optickém mikroskopu již nepozorovatelné. Hranice zvětšení optického mikroskopu je dána vlastnostmi světla. Pokud jsou dva body vzdáleny méně, než je polovina vlnové délky dopadajícího záření, jsou tyto dva body nerozlišitelné. Vlnová délka ultrafialového záření je menší než 400 nm, vlnová délka infračerveného záření je větší než 800 nm. V roce 1933 použili němečtí fyzikové Ruska a von Ardenne elektronové paprsky, které lze zaměřovat a soustřeďovat elektrostatickými a magnetickými čočkami. Elektrony si lze představit jako záporně nabité částice, které mají určitou energii a jako vlna mají určitou vlnovou délku, která je této energii nepřímo úměrná. Elektrony jsou vázány v atomu elektromagnetickou silou ke kladně nabitému jádru. Zdrojem elektronů v elektronovém mikroskopu je elektroda, kde působením stejnosměrného napětí rozžhavené vlákno představuje záporný elektrický pól, katodu. Katoda je umístěna v horní části elektronového mikroskopu. Kladný pól je vybudován jako prstenec v nižší části elektronového mikroskopu. Tímto prstencem elektrony procházejí. Oba póly jsou spojeny s agregátem vysokého napětí asi 50 000 V. Toto napětí udělí elektronům značné zrychlení a vysokou rychlost, čímž se zvýší jejich dolet. Elektronový mikroskop mezi katodou a anodou má vysoké vakuum, aby nedocházelo k pohlcování elektronů vzduchem. Účinný systém za sebou řazených vývěv vytváří prostředí, ve kterém elektrony mohou uletět dráhu až dvou metrů.

Po průchodu anodou se paprsek kondenzoru spojí a zaměří na pozorovaný předmět. Ten je umístěn na malé síťce z měděného drátu, která má průměr asi dva milimetry. Tato síťka slouží zároveň jako ochrana před teplem, které vzniká průchodem elektronů předmětem. Jako u optického mikroskopu procházejí paprsky dále clonami a čočkami, jejichž roli zde přejímají prstencové elektromagnety. Nakonec paprsky dopadají na fluorescentní projekční destičku. Na ní se objevuje obraz předmětu. Místa, jimiž elektrony procházejí se jeví jako světlá, místa, kam elektrony nedopadají, zůstávají tmavá. Pokud se dosáhne dobrého obrazu, fluorescentní destička se odstraní a místo ní se vloží fotografická deska. Nakonec nastupuje běžná fotografická praxe.

Příprava předmětů pro pozorování využívá různé prostupnosti elektronů a tím i konečného zviditelnění struktur. Průchodnost elektronů závisí na atomových hmotnostech prvků, ze kterých se předmět skládá. Čím větší atomovou hmotnost prvek má, tím je látka méně prostupná. Živá hmota je složena převážně z lehkých prvků, vodíku, uhlíku, kyslíku, dusíku, síry a fosforu. Z takových preparátů bychom získali jen velmi málo kontrastní zobrazení. Proto se na preparát vnáší těžké kovy, jako je wolfram, platina, osmium nebo uran. Nejlépe je, pokud jsou studované částice rozptýleny v tekutině. Vzorek se nechá za kontrolovaných podmínek uschnout a jednotlivé částice zůstanou naplaveny na vzorku. Vzorek se pak vloží do zvláštní vakuové komory, aby ležel pod v určitém úhlu vzhledem k platinové elektrodě. Do elektrody se zavede elektrický proud, až se elektroda rozžhaví do běla a odpaří se. Platinové páry pak kondenzují na povrchu vzorku.

Pokud se spíše zajímáme o jemnou strukturu v našem buněčném extraktu, použijeme metody negativního barvení. Vzorek se smísí se solí těžkého kovu a usuší se. Roztok těžkého kovu utvoří film, který bude přerušen v místě, kde se nachází nějaká částice. Vnikne však do všech skulin a dutin tělíska a tím vymodeluje jeho vzhled. Obraz bude mít temné pozadí, na němž vyniknou předměty se svými vnitřními strukturami, odtud termín "negativní barvení". Rozlišovací schopnost této metody je tak dobrá, že lze rozpoznat jednotlivé molekuly bílkovin.

Jestliže pracujeme se živočišnými nebo rostlinnými tkáněmi, musíme z nich nejprve připravit tenké řezy. Malý blok této tkáně fixujeme roztokem těžkého kovu a zalijeme do umělé pryskyřice, kterou necháme ztvrdnout. Dalším krokem je zhotovení ultratenkých řezů. Byl proto vytvořen komplikovaný přístroj ultramikrotom, který je schopen vytvářet řezy o síle jen pět stotisícin milimetru a z jedné buňku jich může vytvořit až pět set.

                                                                                                - pokračování -

(c) 1997 Intellectronics

časopis o přírodě, vědě a civilizaci